背景：　　视网膜变性（retinal degeneration，RD）是一组视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞或/和光感受器细胞功能异常所引起的视网膜光感受器细胞凋亡的致盲性眼病，无法自身修复，严重影响患者生活质量。由于光感受器细胞无法再生，目前尚无有效的治疗方法。视网膜变性疾病的治疗是国内、外研究的一个热点问题，目前尚处于探索性研究阶段，主要治疗方法有基因治疗、细胞移植治疗、药物治疗、人工视觉假体等。　　由于变性的光感受器细胞无再生能力，移植健康的视网膜细胞替代或挽救光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞，成为最具前景的治疗策略之一，也是最有可能实现从基础研究到临床转化的方法。美国先进细胞技术（Advanced Cell Technology, ACT）公司获得美国食品与药品管理局（ Food and Drug Administration，FDA）批准进行细胞移植治疗Stargardt病和干性年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration，AMD）的Ⅰ/Ⅱ期临床实验，研究结果显示细胞移植后可以改善或维持部分患者的视功能，这对于细胞移植治疗视网膜变性疾病具有重要意义。　　目前治疗致盲性眼病常用的眼治疗细胞包括来源于胚胎干细胞，间充质干细胞，诱导多能干细胞，胚胎视网膜祖细胞，成体视网膜干细胞等。　　虽然胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)是临床转化的理想种子细胞之一，但仍存在着致瘤性，免疫排斥等风险，间充质干细胞和诱导多能干细胞存在分化效率低等问题。　　组织特异性视网膜祖细胞（retinal progenitor cell, RPC）具有一定的增殖、分化能力，安全性较高，是较理想的细胞来源。目前，用于移植的视网膜祖细胞多来源于胚胎视网膜或成体视网膜锯齿缘处潜在的具有干细胞特征的细胞，该群细胞多未经纯化，因此移植的细胞内含有多种细胞或处于发育不同阶段的细胞群。　　随着流式细胞术的不断发展，为分离纯化RPC提供了重要的技术手段，但通过流式分选纯化细胞，需要应用细胞表面抗原来特异性标记分选细胞，目前对于RPC表面标记物的研究较少，因此找到一种可以纯化RPC的表面抗原物，将为RPC的研究提供重要帮助。　　酪氨酸蛋白激酶受体( tyrosinese Kit or CD117 or c-kit)，是位于细胞膜的识别抗原，具有可进行流式细胞术分选细胞的优势，在造血干细胞、肥大细胞等细胞中表达，对于细胞的生存、增殖和抗凋亡过程中发挥重要作用。近年研究显示，c-kit抗原在器官来源的祖细胞中同样表达，并且该类细胞具有自我更新、形成克隆和多向分化的潜能。肺来源的c-kit+干细胞移植肺损伤模型后可分化为细支气管，肺泡等结构，并整合到宿主体内修复受损组织，心脏中分离出的c-kit+干细胞，移植后对损伤的心肌组织有修复作用。　　在小鼠胚眼视网膜中已发现存在c-kit+视网膜祖细胞，人胚眼视网膜中是否可以分离培养c-kit+视网膜祖细胞尚未见报道，本研究拟应用c-kit作为表面抗原分选培养该群细胞，并对其生物学特性进行鉴定。　　在小鼠胚胎早期视网膜中存在c-kit与胚胎干细胞标记物阶段特异性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA1)双阳性细胞，为进一步降低致瘤性的风险，排除胚眼视网膜祖细胞中的胚胎干细胞，本研究中应用阶段特异性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA)作为胚胎干细胞的标记，由于SSEA抗原在人ESC中和鼠ESC中表达不完全一致，人ESC中不表达SSEA1而是表达SSEA4，故本研究拟采用c-kit与SSEA4作为表面标记物，分选c-kit+/SSEA4-人胚眼视网膜来源的RPC，对该群细胞的生物学特性进行鉴定，检测c-kit+视网膜祖细胞移植至视网膜色素变性动物模型皇家外科学院(Royal college of surgeon, RCS)大鼠视网膜下腔后的存活、迁移、分化情况，以及其对光感受器细胞和视功能的影响，并将c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞移植至严重联合免疫缺陷小鼠皮下进行安全性检测，以期得到纯化的人胚眼来源的视网膜祖细胞，为细胞移植治疗或延缓视网膜变性类疾病提供一种理想的种子细胞。　　第一部分不同胎龄人胚眼中c-kit+/SSEA4-细胞的分布　　目的：　　检测9-16周胎龄人胚眼来源的c-kit+/SSEA4-细胞在眼组织中的分布。　　方法：　　人胚胎来源于第三军医大学附属西南医院胚胎组织库，通过双顶径和胎儿足长确定胎龄，设置9-10周组，12-13周组，15-16周组三组，通过对人胚眼冰冻切片行免疫组织化学染色检测c-kit+/SSEA4-细胞在胚眼视网膜中的分布，利用流式细胞术检测不同胎龄人胚眼视网膜来源的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞含量。　　结果：　　1．9-16周胎龄胚眼视网膜、脉络膜中均存在c-kit+/SSEA4-细胞，该群细胞在视网膜多分布于内层，其中周部和周边部c-kit+/SSEA4-细胞较后极部视网膜分布多；在脉络膜的后极部及周边部均呈散在分布。　　2．胚胎9-10周，12-13周，15-16周视网膜c-kit+/SSEA4-细胞比例分别为2.58±0.35％，4.62±0.60%，4.97±0.99%，9-10周胚胎视网膜c-kit+/SSEA4-细胞比例低于12-13周胚胎视网膜（P<0.05）及15-16周胚胎视网膜（P<0.05），12-13周c-kit+/SSEA4-细胞比例与15-16周胚眼视网膜差异无统计学意义（P>0.05）。　　结论：　　1．9-10周人胚眼视网膜c-kit+/SSEA4-细胞比例低于12-13周胚眼视网膜及15-16周胚眼视网膜，12-13周c-kit+/SSEA4-细胞比例与15-16周胚眼视网膜差异无统计学意义。　　2．人胚眼视网膜、脉络膜中均存在c-kit+/SSEA4-细胞，视网膜内c-kit+/SSEA4-细胞多分布在视网膜内层，中周部和周边部c-kit+/SSEA4-细胞分布较后极部视网膜多；脉络膜上腔的c-kit+/SSEA4-细胞呈散在分布。　　3．确定分离培养9-13周人胚胎中视网膜c-kit+/SSEA4-细胞。　　第二部分人胚眼c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞增殖分化能力的研究　　目的：　　分选培养人胚眼视网膜来源的c-kit+/SSEA4-细胞，并鉴定其增殖，分化能力。　　方法：　　通过对视网膜细胞分离、培养和扩增，采用流式细胞术筛选人胚眼视网膜来源的c-kit+/SSEA4-细胞，利用流式细胞术，细胞免疫荧光染色，克隆形成实验，细胞增殖周期，绘制增殖曲线等方法，检测c-kit+/SSEA4-细胞的视网膜祖细胞特性，增殖能力以及分化为视网膜终末细胞的潜能。　　结果：　　1． c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞分选后在呈贴壁和悬浮培养条件下均可存活，贴壁生长条件下细胞呈单层生长，形态不规则，多呈梭型；悬浮培养下以克隆球形式生长。　　2．c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞表达视网膜祖细胞标记物Pax6(91.6±2.7%), Sox2(95.2±2.0%), Rax(94.1±2.5%),和Nestin(98.9±2.8%)，不表达造血干细胞标记物(CD11b和CD45)和间充质干细胞标记物(CD29和CD140b)。　　3．c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞具有较强的增殖能力，82.0±3.1%的细胞表达细胞增殖标记物Ki67，细胞周期检测结果显示41.13±2.99%的细胞处于分裂增殖期（S期和G2/M期），增殖曲线显示c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞在贴壁培养条件下培养7天后达到增殖平台期，细胞可增殖20倍以上。c-kit+/SSEA4-细胞在贴壁和悬浮培养条件下均具有形成克隆的能力。　　4．在分化培养基诱导下，c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞在分化条件下可表达感光前体细胞特异性标记物Otx2（49.9±4.1%)，Crx(59.9±4.0%)，光感受器细胞特异性标记物recoverin(68.1±5.1%)，rhodopsin(4.0±0.3%)，节细胞特异性标记物Thy1(29.1±5.4%）及胶质细胞特异性标记物GFAP（66.7±5.8%）。　　结论：　　1． c-kit可作为人胚眼视网膜祖细胞表面标记物，通过流式分选的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞能传代培养，并具有视网膜祖细胞特性。　　2．人胚眼来源的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞具有自我更新能力，克隆形成能力。　　3.人胚眼来源的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞具有分化为光感受器细胞、节细胞、胶质细胞等视网膜终末细胞的能力。　　第三部分人胚眼c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞移植治疗视网膜变性有效性及安全性的研究　　目的：　　观察c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞移植至RCS大鼠视网膜下腔后的存活、迁移、及分化能力，移植细胞对光感受器细胞和视功能的影响，并进行安全性检测。　　方法：　　应用活细胞染色标记物CM-DiI将分选后的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞标记，将标记后的c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞移植至出生后3周的RCS大鼠右眼视网膜下腔（n=9），左眼不进行处理，伪手术组（n=9）右眼注射3μl Hanks盐平衡液，对侧眼为空白对照组，不进行任何处理，分别在移植前和移植后4周，8周，12周行视网膜电图（Electroretinogram，ERG）检查，并在预定的时间点通过免疫组织化学染色检测移植细胞的存活、迁移和分化情况，同时测量各组外核层厚度及移植细胞表达光感受器细胞标记物的比例。　　将12只严重联合免疫缺陷小鼠(severe combined immune deficiency，SCID)分为两组，实验组和阳性对照组，分别在腹股沟皮下注射c-kit+细胞和人ESC，观察12周后，处死小鼠检测是否成瘤或其他病变。　　结果：　　1．c-kit+/SSEA4-视网膜祖细胞在移植后4周，8周和12周少量细胞向视网膜内层迁移，移植细胞主要存在于视网膜下腔，在4周，8周，12周，分别有1.01±0.11%，2.36±0.25%，5.22±0.14%表达光感受器细胞特异性标记物recoverin。　　2．移植治疗组视网膜外核层在4周，8周，12周厚度分别为28.43±1.95μm，23.27±0.85μm，19.43±0.84μm，较伪手术组和空白对照组均增厚(7.67±1.08μm，8.50±1.47μm)，（6.61±0.65μm,6.83±1.08μm），（4.17±0.75μm,4.80±1.08μm），差异有统计学意义(n=3, P<0.01)。伪手术组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。　　3．ERG结果显示在移植前各组b波波幅差异无统计学意义，在移植后4周和8周，移植治疗组b波波幅高于对照组和未处理组，差异有统计学意义（P<0.05），移植后12周各组b波波幅差异无统计学意义(P>0.05)。　　4．致瘤性实验结果显示实验组和阳性对照组均未出现免疫排斥反应，实验组小鼠均未见畸胎瘤形成，阳性对照组出现畸胎瘤，发生率33.3%。　　结论：　　1．c-kit+/SSEA4-人胚眼视网膜祖细胞移植至变性大鼠视网膜下腔后可以存活，具有迁移，分化能力。　　2．c-kit+/SSEA4-人胚眼视网膜祖细胞对视网膜外核层光感受器细胞具有一定保护作用，可以延缓光感受器细胞凋亡，并改善ERG b波波幅。　　3．初步安全性检测未发现c-kit+/SSEA4-人胚眼视网膜祖细胞具有致瘤性。