当归芍药散(DSS)是出自《金匮要略》的妇科名方，有养血活血、健脾化湿利水之功能。上世纪80年代末有人用于治疗老年性痴呆取得疗效。研究表明，DSS可改善老年性学习、记忆功能低下鼠的空间学习记忆能力，改善老年小鼠平衡和协调运动功能；提高老年机体抗自由基损害能力；促进衰老时中枢胆碱能神经功能低下的恢复，被认为是一个理想的光谱抗衰老中药方剂。随着年龄的老化，松果体功能逐渐减退，褪黑素分泌逐渐减少，并失去昼夜节律，导致生物钟失调是造成衰老的一个重要因素。应用褪黑素防治神经元退行性病变的机制是目前研究的热点之一，其在抗氧化，线粒体保护，抗Aβ沉淀，抗凋亡以及免疫调节等方面取得了一定的进展。而以往的研究表明：当归芍药散和褪黑激素均有改善学习记忆能力、抗氧化、清除自由基、抗衰老及治疗老年性痴呆的作用。因此二者间是否有着某种联系，即当归芍药散是否可以通过促进褪黑激素分泌从而发挥其一系列作用?有研究表明在不同年龄段的Tg2576转基因AD模型鼠中应用褪黑素治疗，其疗效差异很大，在老年转基因鼠中，褪黑素的抗Aβ和抗氧化效果不明显。当归芍药散抗衰老作用是否也存在与褪黑素类似的疗效差异，当归芍药散与褪黑素对衰老的预防和治疗效果是否相同? 基于以上问题，本实验首先用当归芍药散汤剂灌服老年大鼠21天，探讨其对老年鼠松果体功能有无改善，能否促进褪黑素分泌。在体外实验中，应用Aβ25-35作用于不同衰老程度的原代培养海马神经元，观察当归芍药散和褪黑素的疗效差异。为当归芍药散和褪黑素应用与临床抗衰老和治疗老年性痴呆提供理论依据。 材料和方法: 一、当归芍药散对老年大鼠松果体功能的影响1中药制备当归芍药散一共包含六味中药，中药汤剂煎法如下：中药按比例混合后，加8倍体积的蒸馏水浸泡1h，然后煎2h，收集药水；再往药渣中加6倍体积蒸馏水，煎1.5h，收集药水；将两次收集的药水混合后浓缩成1g生药/ml，放4℃冰箱备用，用时加热至温热。 2实验动物分组和用药血清褪黑素测定采用20月龄的老年SD大鼠分成灌药组和老年对照组，再加上一组三月龄SD大鼠作为青年对照组。其他各实验均用20月龄的老年SD大鼠分为灌药组和对照组。灌药组于晚上11点在微弱红光下灌服DSS3ml，连续用药21天，对照组在同样条件下灌服同体积的蒸馏水。 3取材 (1)采血：灌药第21天上午10:30～11:30于尾静脉采血0.5ml；当天晚上在灌药半小时后在红光下再采血0.5ml。血液采集后经离心，取血清0.3～0.6μml，于4℃冰箱保存数日后移入-20℃冰箱保存。 (2)取松果体：在用药第21天晚上灌完后间隔半个小时，在微弱红光下快速断头处死老鼠，取出松果体。 4血清褪黑素浓度的测定老年大鼠20只，青年大鼠10只，分组以及取材如前述。取得的血清用褪黑激素放免测定试剂合测定褪黑素浓度。 5松果体β-AR、P-CREB与T-CREB、AA-NATmRNA测定松果体β-AR测定需要老年SD大鼠30只，其他两个实验需要老年SD大鼠20只，分组及取材如前述。松果体β-AR测定三个松果体为一个样本，其他两个实验两个松果体为一个样本。取得松果体样本放-70℃保存。分别用[3H]DHA测定松果体β-AR的含量，用western-blot测定总CREB和磷酸化CREB，用real-timeRT-PCR测定AA-NATmRNA的表达。 二、当归芍药散对神经元Aβ损伤的保护 1药物血清的采集老年SD大鼠10只平均分成两组，分别灌服当归芍药散和纯净水(用药时间和药量同前面实验)21天后，在红光下快速处死老鼠，从心脏取血，然后离心(750g)10min，取血清，将血清放入56℃水浴30min，过滤除菌后分别制成了药物血清和空白血清，置-20℃冰箱备用。 2海马神经元的培养和分组本课题组已经成功建立了海马神经元体外模拟衰老模型。 培养10天和25天神经元分别分成5组：A对照组；BAβ25-35组；CAβ25-35+melatonin组；DAβ25-35+空白血清组；EAβ25-35+药物血清组。细胞在培养10天或25天后，B、C、D、E组各加入20μM的Aβ25-35，C、D、E分别加入10μM的褪黑素、5％的空白血清和5％的药物血清，每孔体积100μL。 3当归芍药散对Aβ25-35所致神经元氧化应激、线粒体膜电位损伤及PGC-1α表达影响的检测培养10天和25天神经元均给予20μM的Aβ25-35刺激，同时分别应用5％的药物血清和10μM的褪黑素干预24h后，用荧光探针DCFH-DA(20μM)或荧光染料罗丹明123孵育，在微孔板荧光酶标仪分别检测细胞内氧自由基含量和线粒体膜电位值的变化；应用谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(比色法)测定细胞匀浆中GSH含量。利用Westernblot检测神经元细胞PGC-1α蛋白表达的变化。 结果: 一、当归芍药散对老年大鼠松果体功能的影响1老年大鼠夜间血清褪黑素浓度(11.395±0.532)较青年大鼠(39.696±2.631)明显降低(P<0.01)，而白天浓度无显著性差异。 2灌药组老年大鼠与对照组老年大鼠白天血清中褪黑素浓度也无显著性差异，但灌药三周后老年大鼠晚上血清中褪黑素的浓度(27.239±1.906)比对照老年大鼠(11.395±0.532)明显增高(P<0.01)，尚未达到青年大鼠水平(39.696±2.631)。 3灌服DSS的老年大鼠松果体夜间信号转导增强：[3H]-DHA的特异性结合明显升高(P<0.035)；NATmRNA的表达明显升高(p<0.05)；CREB的磷酸化增强(P<0.05)，但总CREB的表达没有发生变化。 二、当归芍药散对海马神经元Ap25-35损伤的保护1Aβ25-35刺激使神经细胞氧自由基显著增高、GSH减少、线粒体膜电位降低和PGC-1α表达减少(P<0.01)。 2当归芍药散不管对培养10d还是25d的海马神经元，对于氧自由基的增高和GSH减少都有明显的改善作用(P<0.01)，并都可以改善线粒体膜电位(P<0.01)和促进PGC-1蛋白的表达(P<0.05)。 3对于氧自由基的增高和GSH减少，培养10d和25d后应用褪黑素，都有明显的改善作用(P<0.05)；而线粒体膜电位的改善和PGC-1蛋白的表达方面，褪黑素只对培养10d的神经元有作用(P<0.05)，对培养25d的神经元改善作用不明显(P>0.05)。 结论: 一、当归芍药散改善老年大鼠的松果体功能1DSS可以提高老年大鼠夜间血清褪黑素浓度，并恢复其昼夜节律。 2DSS使松果体内褪黑素分泌所需要的cAMP依赖性信号通道明显增强，本实验发现其可以促进松果体β-AR、NATmRNA的表达，并促进CREB的磷酸化。 二、当归芍药散与褪黑素对不同衰老程度神经元Aβ25-35损伤的保护效果有差异。 1当归芍药散与褪黑素能改善Aβ25-35引起的神经细胞内氧自由基升高和GSH值降低，对不同衰老程度的神经元均有保护效果； 2当归芍药散能改善不同衰老程度神经元Aβ25-35引起的线粒体膜电位降低，而褪黑素对衰老神经细胞作用不明显； 3Aβ25-35能降低神经细胞PGC-1α的表达，当归芍药散能防止Aβ25-35引起的不同衰老程度神经元PGC-1α蛋白表达降低，而褪黑素对衰老细胞效果不明显。 总之，本研究发现当归芍药散可以促进老年大鼠松果体夜间褪黑素的分泌，其抗衰老功能可以通过促进褪黑素的分泌实现，同时可能有其他途径存在。