近年来对肠道微生物的研究暗示了其在一系列对宿主健康至关重要的包括能量平衡、代谢,肠上皮健康、免疫活动和神经发育等生理过程中发挥着重要作用。肠道微生物也受到来自宿主方面的多种因素影响,包括年龄、性别、饮食、遗传和生活方式等,因此肠道菌群一直处于动态变化中。肠道环境相对无氧,更利于厌氧菌生长。众所周知,抗生素对肠道菌群有着明显的持续抑制作用,使肠道菌群对某些病原体的定植抗性降低,原本的优势菌群处于虚弱状态,肠道菌群平衡被打破,此时,定居在肠道内的条件致病菌便会趁虚而入,引发各种疾病,其中就包括艰难梭菌。艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种革兰氏阳性、专性厌氧的梭状芽孢杆菌,正常存在于人体肠道内,属于条件致病菌。当肠道内菌群平衡被打破时,艰难梭菌会过度增殖且释放大量毒素,进而引发各种肠道疾病。近十年来,由于艰难梭菌感染导致的高发病率、死亡率和医疗保健费用,引起了人们对它的高度关注。高龄和应用抗生素治疗的住院患者是艰难梭菌感染的主要危险因素,因此,艰难梭菌也被认为是引发医疗相关性感染的常见病原体。然而,到目前为止尚未有理想的、满足临床需求的艰难梭菌感染的诊疗方法,因此,加强对艰难梭菌的生理代谢基础研究及临床感染研究,加快研发艰难梭菌检测方法和防治手段尤为重要。我们通过蛋白序列Blast分析发现,艰难梭菌基因组中含有NfnAB的编码基因。这种酶涉及的基于黄素的电子歧化机制是近年来在梭菌中发现的一种新型能量代谢方式,被认为是微生物除底物水平磷酸化和氧化磷酸化的第三种能量守恒方式。因此本论文对艰难梭菌中的NfnAB进行了异源表达、纯化和生化反应研究。结果显示重组蛋白NfnAB在大肠杆菌E.coli C41(DE3)′中得到了高效表达,SDS-PAGE检测结果显示经纯化获得了高纯度的目的蛋白,该蛋白由两个大小分别为51 kDa和33 kDa的亚基组成;紫外扫描结果显示重组表达的NfnAB在390 nm和430 nm处展现出了特异性的吸收峰,这与艰难梭菌NfnAB含有FAD和铁硫簇辅因子的设想一致。酶活测定显示该酶具有NAD~+依赖的NADPH还原TTC和Fd的活性。这些生化性质与已报道的其它专性厌氧菌对应的酶所展现的性质一致,表明它们具有相同的生化功能。铁氧还蛋白(Ferredoxin,Fd)作为迄今为止报道的所有电子歧化酶催化的特异性反应中都需要的反应底物,到目前为止尚没有一种适用于生化反应测定,产量高,稳定性好,易获取,易保存的Fd的制备方法,因此,迫切需要找到这样一种方法,制备出稳定性好的Fd,以满足新型电子歧化反应涉及到的产能机制研究的需求。所以本论文第二章构建了海热袍菌(Thermotoga maritima)中Fd的重组表达载体,在大肠杆菌E.coli C41(DE3)′中对Fd进行了诱导表达和纯化,并对其进行了紫外扫描检测。结果显示重组Fd在大肠杆菌中获得高效表达;只经过热处理即可去除60%的杂蛋白,经Ni柱亲和纯化后可得到纯度达90%的Fd,紫外扫描结果显示其有[4Fe4S]簇的特征性吸收峰;重组Fd铁含量测定结果为Fe与蛋白的摩尔比值约为4,与预期结果相符。以热处理后的重组Fd作为电子受体测得海热袍菌的NfnAB在45℃条件下催化NADPH还原Fd的比酶活约为4.6 U/mg,说明本论文制备的Fd可以作为电子歧化反应的底物。此外,本章实验还摸索了Fd在不同保存条件下的稳定性,结果表明Fd最佳保存条件为-20℃厌氧保存。本论文第四章进一步对艰难梭菌基因组信息进行分析,通过文献调研和基因组分析,根据已见报道的厌氧菌中的基因组信息,通过序列比对等手段进行生物信息分析。结果显示艰难梭菌中物质与能量代谢相关蛋白与已见报道的厌氧菌中的同种蛋白具有较高的一致性,说明这些厌氧菌中物质与能量代谢相关的蛋白具有高度保守性。根据上述基因组分析数据,绘制了艰难梭菌在自养和异养生长条件下的代谢途径,并且发现在艰难梭菌的整个代谢途径中,至少涉及三种电子歧化酶,分别为NfnAB、Bcd/Etf和Hyd,说明电子歧化机制确实在厌氧菌代谢中发挥着重要作用。