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肌肉品质是猪育种中长期关注的性状,肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)是影响猪肉品质的关键因素,与猪肉风味高度相关。另一方面,异位脂肪沉积则能导致多种人类的肌肉代谢病,说明骨骼肌和脂肪组织既独立又紧密联系。研究表明,骨骼肌和脂肪组织间存在调控信号互作,且成肌细胞能转分化为脂肪细胞,而microRNA(miRNA)在其中发挥着重要的调控作用。但是miRNA在这一过程中发挥的具体机制,例如控制其转录活性的调控元件、转录因子等尚不清楚。因此本研究运用染色质免疫共沉淀及高通量测序(ChIP-Seq)和染色质转座酶可接近性测序(ATAC-Seq)等表观遗传学研究方法,全面分析了猪骨骼肌和脂肪组织中miRNA的调控元件及其调控通路,并利用成肌细胞作为模型,进一步验证和分析了 miRNA在成肌细胞转分化为脂肪细胞过程中的调控机理及miRNA自身表达调控的机制。本研究主要结果如下:(1)在本实验室建立了组织及细胞ChIP-Seq和ATAC-Seq实验平台:摸索并优化了猪骨骼肌和脂肪组织的样品裂解、染色质片段剪切、免疫共沉淀、Tn5转座酶切及测序文库构建等试验流程,并且对试验过程及数据质量进行严格质控。本研究得到的数据符合基因组DNA百科全书(ENCODE)计划要求的数据质量标准。(2)在全基因组范围内,对猪骨骼肌和脂肪组织的启动子和增强子元件及染色质开放性区域鉴定:进行了组蛋白因子H3K4me3和H3K27ac的ChIP-Seq实验并分析了富集情况,在猪骨骼肌和脂肪组织中分别鉴定了 22670和30045个增强子,17735和20438个启动子,其中活跃启动子数目约占总启动子数目的90%。根据ATAC-Seq结果,在猪骨骼肌和脂肪组织中分别鉴定了 57936和66785个染色质开放性区域。(3)猪骨骼肌和脂肪组织共有及特异的启动子和增强子信号及染色质开放性区域鉴定:主要分为3类:骨骼肌组织中获得性区域(Gain)及脂肪组织缺失性区域,两种组织中共有区域(Stable),以及骨骼肌组织中缺失性区域(Loss)即脂肪组织获得性区域。对启动子和增强子信号进行GO功能注释分析,Gain区域中显著富集到与肌肉器官发育相关的信号通路,Loss区域显著富集了脂联素和脂蛋白等介导的信号通路。对染色质开放性区域进行motif分析:Gain区域与MEFs家族、MYOG和MYF5等调控骨骼肌发育的转录因子相关,Loss区域则富集到CEBPB、ATFs、PPARG等调控成脂发生的转录因子。表明这些启动子和增强子信号及染色质开放性区域具有组织特异性。(4)猪骨骼肌和脂肪组织miRNA的启动子、增强子分析:在两种组织中,miRNA上下游50kb的范围内有明显的H3K4me3、H3K27ac及ATAC-Seq的信号分布,共鉴定了 341个miRNA的启动子,其中207个为活跃启动子。本研究鉴定的启动子中63.02%有CpG岛富集,根据CpG岛主要位于基因启动子区域的特性,表明本研究鉴定的启动子合理可靠。此外,鉴定了 373个潜在的miRNA增强子。约50%的miRNA启动子和增强子信号位于距miRNA 20kb的范围内。(5)猪骨骼肌和脂肪组织中,miRNA的启动子和增强子区域与基因组染色质开放性区域有重叠:在两种组织中有86.57%的miRNA启动子区域和60.96%的miRNA增强子区域与染色质开放性区域重叠,表明ATAC-Seq信号能较好的地覆盖H3K4me3和H3K27ac预测的区域,对这些区域进行motif富集分析,发现miRNA的表达受转录因子的调控。(6)成肌细胞作为细胞模型在成脂分化培养基中可以诱导成脂且染色质开放性区域发生变化:成肌细胞在生长培养基中达到80%密度时,加成脂分化培养基进行诱导,诱导7d细胞形成大量脂滴且伴随着成脂关键基因Cebpa、Fabp4、AdipoQ、Di02和Cidea的上调表达。增殖期和诱导成脂两类细胞的ATAC-Seq染色质开放性区域具有明显差异。(7)猪骨骼肌和脂肪组织中差异表达miRNA和成肌细胞诱导成脂过程中的差异表达miRNA分析:本研究在猪骨骼肌和脂肪组织中共鉴定了 160个差异miRNA,成肌细胞成脂过程中有52个差异miRNA,其中21个差异miRNA在组织和细胞中同时差异表达。GSEA富集结果显示,诱导成脂过程中,超过70%的差异miRNA主要参与成脂过程的基因表达调控。这些差异miRNA的靶基因主要调控Wnt、MAPK以及胰岛素信号通路。(8)组织和细胞中差异miRNA 20kb范围内的染色质开放性区域主要富集了AP-1相关转录因子和KLFs家族:转录因子AP-1、KLFs调控差异表达miRNA,差异miRNA作用于靶基因,进而影响胰岛素、Wnt和MAPK等信号通路,最终调控转录轴Foxol-Ppargcla-Ppara-Rxrg-Pparg,从而参与骨骼肌细胞向脂肪细胞的转分化调控。说明这些转录因子在骨骼肌和脂肪组织及成肌细胞诱导成脂过程中对差异miRNA发挥重要的调控作用。