研究背景及意义支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘,是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。气道慢性炎症作为哮喘的基本病理改变,在哮喘病程中持续存在,是导致哮喘气道高反应性和症状反复发生的重要原因之一。因此,如何控制哮喘的慢性气道炎症是哮喘基础和临床研究的热点。与COPD的慢性炎症不同,哮喘气道炎症以Th2型炎症为主,典型表现为支气管粘膜内大量激活的嗜酸性粒细胞、肥大细胞、Th2型细胞等炎性细胞浸润,激活的Th2型细胞产生大量的Th2型细胞因子。目前的研究表明Th2型细胞和Th2型细胞因子在哮喘慢性气道炎症中发挥重要作用。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可以促进DC成熟,TSLP-DCs调控CD4+T细胞向Th2型细胞发展。TSLP-DCs可以促进CD4+T细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子。与正常对照小鼠比较,OVA致敏激发的哮喘小鼠肺部TSLP mRNA表达显著增加,而且肺泡灌洗液中TSLP蛋白水平升高。肺部特异性高表达TSLP的转基因小鼠,出现自发性气道炎症,伴气道高反应性、嗜酸细胞浸润、血清IgE升高、IL-4、IL-5、IL-13等Th2型因子分泌增加,肺部病理显示大量CD4+淋巴细胞浸润、杯状细胞增生、粘膜下纤维化。CD4+淋巴细胞表达趋化因子受体CCR4显著增加。转基因的特应性皮炎小鼠模型的皮肤角质细胞过度分泌TSLP,造成血清TSLP升高,能够诱发小鼠严重的哮喘发作。支气管粘膜活检提示哮喘病人气道上皮表达TSLP比正常人明显升高,并且与Th2细胞趋化因子表达相关,与疾病的严重程度相关。以上研究显示TSLP在哮喘Th2型炎症中发挥一定的作用。以上研究均提示,TSLP是一种启动和维持哮喘Th2型炎症的重要因子。气道上皮细胞(Airway epithelial cell, AEC)是哮喘气道中TSLP的主要来源,病毒(鼻病毒、呼吸道合胞病毒等)感染可导致AEC分泌TSLP升高。我们的前期研究也证实,哮喘小鼠模型感染呼吸道合胞病毒后,肺组织中TSLP分泌增加,Th2型炎症加重,病毒复制的中间产物dsRNA、人工合成的dsRNA(polyI:C)都可以刺激AEC产生TSLP, TSLP促进Th2型细胞因子的分泌,而且在反过来Th2型细胞因子(IL-4、IL-13等)的协同作用下,AEC分泌TSLP显著增多。这种正反馈机制更好地促进和放大了TSLP启动的Th2型炎症反应。有学者认为TSLP是感染与哮喘气道变应性炎症之间的桥梁,阻断TLSP就有降低感染引起的哮喘气道变应性炎症的可能。TSLP作为哮喘慢性气道炎症的关键分子,已经被选为哮喘治疗的新靶点。目前,AEC分泌TSLP的信号转导机制尚不明确,有实验提示与核因子κB密切相关。有研究报道哮喘患者的诱导痰中TSLP水平与健康人无显著差异,而且在致敏原激发后诱导痰中TSLP水平反而下降,这唯一的有关诱导痰TSLP水平的研究结果与之前的研究十分矛盾,是否真实的反应了临床实际情况?反应了哮喘气道上皮分泌TSLP的真实情况?需要我们进一步研究。过氧化物酶增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)是一类由配体激活的转录因子家族,有三种亚型PPAR-α, PPAR-β和PPAR-γ。近年来的研究证实PPAR-γ活化后具有抗炎和免疫调节作用,可以调控炎症因子的生成、炎症细胞趋化、细胞分化和增生和凋亡。作为调控炎症的新靶点,PPAR-γ近年被引入哮喘研究。有临床病例报道,服用PPAR-γ激动剂吡格列酮有益于控制哮喘症状。国外学者已经尝试进行小规模的临床实验,已完成的临床实验提示在吸烟的哮喘患者中,口服常规剂量的罗格列酮对比吸入倍氯米松能更好的改善FEV1。PPAR-y在肺内的结构细胞(上皮细胞、气道平滑肌细胞、肺成纤维细胞)和炎症细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、DC、中性粒细胞、淋巴细胞)中都有表达。有研究显示在哮喘小鼠和哮喘患者的肺部PPAR-y表达增加。PPAR-y激动剂可抑制哮喘动物模型的气道Th2型炎症,尤其是抑制哮喘的Th2型细胞因子的分泌,降低抗原诱导的气道高反应性、肺部炎症、肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞数目,甚至可以减轻气道重塑。这种抑制作用被PPARy特异性拮抗剂GW9662所消除,这就充分证实了PPAR-y激动剂的这些作用是由PPARy通路介导的。PPAR-y抗炎机制仍未研究清楚,有实验表明PPAR-y活化后通过抑制NF-κB活性来抑制炎性介质的产生。PPAR-y激动剂是否通过抑制NF-κB调控TSLP的表达?是否通过影响TSLP的表达而调控哮喘气道炎症的发生发展?目前尚不清楚,有待进一步探索。本研究首先通过检测哮喘患者和正常人血浆和诱导痰液中TSLP的水平,对比分析TSLP在哮喘气道中的表达情况及与肺功能、病情严重程度的相关关系,初步了解TSLP在哮喘诊治中的临床意义。在细胞水平上,我们在前期建立的人工合成dsRNA (poly I:C)刺激人支气管上皮细胞16HBE分泌TSLP的模型基础上,研究PPAR-γ激动剂罗格列酮、替米沙坦对上皮细胞表达TSLP的调控作用,并探讨其可能机制。在小鼠的哮喘模型上,我们从整体水平观察PPAR-γ激动剂罗格列酮和替米沙坦对气道Th2型炎症和气道高反应性的影响,通过检测血清、肺组织及肺泡灌洗液中TSLP表达情况,初步明确PPAR-γ经由调控TSLP表达对哮喘慢性气道炎症的影响。研究方法一、临床标本检测1、制定支气管哮喘患者和健康人入组标准和排除标准；2、收集患者基本资料和行肺功能检查；3、收集和处理患者诱导痰和外周血标本；4、最后ELISA法检测患者的血浆和诱导痰中TSLP的表达水平；5、进行统计学分析。二、体外细胞学实验1、培养人支气管上皮细胞株16HBE；2、MTT比色法检测不同浓度的罗格列酮、替米沙坦、GW9662对16HBE细胞活力的影响：在0、0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM6个浓度罗格列酮、替米沙坦、GW9662分别与16HBE共同培养,MTT比色法观察细胞活力情况。3、观察Poly I:C刺激不同时间对16HBE TSLP mRNA和PPAR-y mRNA表达的影响：以25ug/ml浓度的Poly I:C刺激,按不同刺激时间分成6组,每个时间点均设空白对照组,分别为刺激0h、3h、6h、9h、12 h、24h后提取细胞总RNA,逆转录,Real time-PCR检测TSLP mRNA和PPAR-y mRNA表达水平。4、观察罗格列酮、替米沙坦、GW9662对16HBE表达TSLP mRNA和蛋白的影响：罗格列酮(10μM)、GW9662(10μM)、替米沙坦(20μM)加入细胞培养基孵育3小时,Real time-PCR检测TSLP mRNA表达水平。孵育24小时,留取细胞培养基上清,ELISA检测TSLP浓度。5、观察罗格列酮、替米沙坦对Poly I:C刺激16HBE表达TSLP mRNA和蛋白的影响：试验分6组：对照组(用培养基替代Poly I:C); Poly I:C组(加入最终浓度为25μg/ml的Poly I:C)；罗格列酮干预组(在加入25μg/ml Poly I:C前1小时加入10μM罗格列酮预处理)；罗格列酮+GW9662干预组(在加入罗格列酮前1h加入10μM GW9662预处理,其他处理与罗格列酮组相同)；替米沙坦干预组(在加入25μg/ml Poly I:C前1小时加入20μM罗格列酮预处理);替米沙坦+GW9662干预组(在加入替米沙坦前1h加入10μM GW9662预处理,其他处理与替米沙坦组相同)。Poly I:C刺激3小时,Real time-PCR检测TSLP mRNA表达水平。刺激24小时,留取细胞培养基上清,ELISA检测TSLP浓度。6、观察NF-κB抑制剂Bay 11-7082对Poly I:C刺激16HBE表达TSLP mRNA的影响试验分4组：对照组(用培养基替代处理因素)；Poly I:C组(加入25μg/mlPolyI：C共孵育)；Bay 11-7082 10μM组(在加入Poly I:C前1小时加入10μM Bay 11-7082共孵育)；Bay 11-7082 20μM组(在加入Poly I:C前1小时加入20μM Bay 11-7082共孵育)。三、动物实验1、40只6周龄清洁级BALB/c雌性小鼠分为5组：对照组、哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组、替米沙坦组。2、OVA致敏激发小鼠建立支气管哮喘小鼠模型,同时给予不同的处理因素：3、无创肺功能检测小鼠气道反应性：不同浓度乙酰甲胆碱激发,BUXCO无创肺功能检测仪检测Penh值。4、处死小鼠,留取血液和支气管肺泡灌洗液,肺泡灌洗液进行细胞分类及计数。5、ELISA检测血清及肺泡灌洗液中TSLP浓度,ELISA检测肺泡灌洗液中IL-4和INF-γ的浓度。6、小鼠肺脏组织的取材制片、HE染色、PAS染色及病理评价；7、小鼠肺脏组织免疫组化观察TSLP、p65表达情况；四、统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析,资料以均数±标准差(-X±s)表示。方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法和SNK法检验,方差不齐时总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验。样本率和构成比比较用X2检验。相关分析采用Spearman相关分析.以P<0.05为有统计学意义。实验结果一、临床实验结果1、共收集24个健康人、39个哮喘患者的合格的诱导痰和血液标本。其中嗜酸性粒细胞型支气管哮喘26例,非嗜酸性粒细胞型支气管哮喘13例。轻度支气管哮喘12例,中度支气管哮喘13例,重度支气管哮喘14例。2、哮喘组血浆TSLP浓度(65.15±33.67pg/m1)比对照组(1.07±2.39pg/m1)显著升高(P<0.001)。哮喘组诱导痰TSLP浓度(17.47±21.16pg/m1)显著高于对照组(0.28±0.81pg/m1)(P<0.001)。3、重度哮喘组血浆TSLP浓度显著高于轻度哮喘组(P<0.001),而与中度哮喘组之间无显著差异(P=0.069)。中度哮喘组血浆TSLP显著高于轻度哮喘组(P=0.027)。重度哮喘组诱导痰TSLP浓度显著高于轻度、中度哮喘组(P=0.004,P=0.017),中度哮喘组诱导痰TSLP浓度与轻度哮喘组之间无显著差异(P=0.569)。4、嗜酸性粒细胞型哮喘组与非嗜酸性粒细胞型哮喘组相比,血浆和痰液TSLP浓度无显著差异(P=0.602,P=0.060)。5、哮喘患者的血浆TSLP浓度与痰液TSLP浓度成正相关(r=0.453,P=0.004)。6、诱导痰TSLP浓度与FEV1绝对值、FEV1占预计值百分数、FEV1/FVC均成负相关,与FEVl占预计值百分数相关系数最大(r=-0.504,P=0.001)。诱导痰TSLP浓度与ACQ5有一定的相关性(r=0.330,P=0.040)。7、血浆TSLP浓度与白天症状评分呈正相关(r=0.365,P=0.022),与ACQ5、夜间症状评分无相关性。血浆TSLP浓度与FEV1绝对值、FEV1占预计值百分数、FEV1/FVC均成显著负相关,与FEV1占预计值百分数相关系数最大(r=-0.513,P=0.001)。8血痰液TSLP浓度与痰嗜酸性粒细胞百分数(r=0.337,P=0.036)、痰嗜酸性粒细胞总数(r=0.365,P=0.022)之间呈正相关。二、体外细胞学实验结果1、0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM 5个浓度的罗格列酮、替米沙坦、GW9662对16HBE细胞活力的无显著影响。2、Poly I:C刺激后,随着刺激时间的增加TSLP mRNA的表达先升高,后下降。与0h组TSLP mRNA的表达相比,Poly I:C刺激3h组的TSLP mRNA的表达最高,相当于0h组的4.57±0.66倍,有显著统计学差异；6h组、9h组表达仍显著高于0h组,有显著统计学差异,12h组、24h组TSLP mRNA的表达与0h组无显著差异。3、Poly I:C刺激后,与0h组相比,各时间点PPAR-γmRNA的表达增加并不显著,无统计学差异。4、罗格列酮、替米沙坦、GW9662对正常状态下16HBE TSLP mRNA和蛋白的无显著影响。5、罗格列酮干预组TSLP mRNA表达比Poly I:C组显著降低(P<0.001)。罗格列酮+GW9662干预组的TSLP mRNA表达比罗格列酮干预组显著升高(P<0.001),与Poly I:C组比较无显著差异(P=0.205)。6、替米沙坦干预组TSLP mRNA表达比Poly I:C组显著降低(P<0.001)。替米沙坦+GW9662干预组TSLP mRNA表达比替米沙坦干预组显著升高(P=0.012),但是仍显著低于Poly I:C组(P=0.012)。替米沙坦干预组TSLP mRNA表达与罗格列酮干预组比较无显著差异(P=0.113)。7、Poly I:C组16HBE TSLP mRNA表达与Bay 11-7082 10μM组之间无显著差异(P=0.073)。Bay 11-7082 20μM组的TSLP mRNA表达与Poly I:C组相比显著降低(P=0.010),提示20μM浓度的Bay 11-7082对Poly I:C刺激16HBE表达TSLP mRNA有显著的抑制作用。Bay 11-7082 20μM组和Bay 11-7082 10μM组的TSLP mRNA表达有显著差异(P=0.039)。三、动物实验结果1、各组小鼠Penh%值均随乙酰胆碱浓度的升高而增加,不同浓度之间有显著性差异(浓度的主效应F=161.512,P=0.000)。不同组别之间有差异(组别的主效应F=15.769,P=0.000),哮喘组小鼠的气道反应性最高,明显高于替米沙坦组、地塞米松组、罗格列酮组、对照组。不同乙酰胆碱浓度与不同组别之间存在交互效应(F=6.503,P=0.000)。当乙酰甲胆碱激发浓度为1.56mg/m1时,哮喘组小鼠的Penh%值显著高于罗格列酮组、对照组,有统计学意义(P=0.030,P=0.033),与地塞米松组、替米沙坦组之间比较无显著差异(P=0.057,P=0.127),罗格列酮组、对照组、地塞米松组、替米沙坦组四组之间无显著差异(P>0.05)。当乙酰甲胆碱激发浓度为3.12mg/m1、6.25mg/m1、12.5mg/m1、25mg/m1时,哮喘组小鼠的Penh%值显著高于其他各组(P<0.05),其他各组之间比较无显著性差异(P>0.05)。当乙酰甲胆碱激发浓度为50mg/m1时,哮喘组小鼠Penh%值显著高于地塞米松组、罗格列酮组、对照组(P<0.05),与替米沙坦组小鼠Penh%值之间比较无统计学意义(P=0.206)。替米沙坦组小鼠Penh%值显著高于地塞米松组、罗格列酮组、对照组(P<0.05),地塞米松组、罗格列酮组、对照组的Penh%值之间无显著差异(P>0.05)2、常规HE染色哮喘组支气管上皮增生肥厚、粘液分泌增加、管腔明显狭窄,管壁及其周围大量淋巴细胞浸润,各治疗组可使炎症减轻。哮喘组气道炎症病理评分显著高于其他各组(X2=1.686,P<0.001),气道炎症评分由高到低依次是哮喘组、替米沙坦组、罗格列酮组、地塞米松组、对照组。3、PAS染色显示哮喘组粘液分泌增加,PAS阳性细胞数目较多,各治疗组PAS阳性细胞数目比较哮喘组均有不同程度的减少,粘液分泌亦有所减少。4、免疫组化显示哮喘组小鼠气道上皮细胞高表达TSLP,各治疗组TSLP表达明显降低。5、免疫组化显示哮喘组小鼠气道上皮细胞高表达p65,各治疗组p65表达明显降低。6、哮喘组小鼠的BALF细胞总数其他各组显著升高(P<0.001)。地塞米松组与替米沙坦组无显著差异(P=0.961),但是显著高于对照组、罗格列酮组(P=0.003,P=0.010)。替米沙坦组显著高于对照组、罗格列酮组(P=0.004,P=0.011)。对照组、罗格列酮组BALF细胞总数无显著差异(P=0.663)。7、哮喘组小鼠的BALF嗜酸性粒细胞总数,对比其他各组均有显著升高(P<0.05)。地塞米松组、罗格列酮组、替米沙坦组各组BALF嗜酸性粒细胞总数之间两两比较无显著差异(P>0.05),三组BALF嗜酸性粒细胞总数显著高于对照组(P<0.05)。8、对照组嗜酸性粒细胞百分数比其他4组显著降低(P<0.05)。哮喘组显著高于地塞米松组、罗格列酮组(P=0.035,P=0.036),与替米沙坦组之间无显著差异(P=0.160)。地塞米松组、罗格列酮组、替米沙坦组之间无显著差异(P>0.05)。9、哮喘组小鼠血清TSLP(35.13±5.94pg/ml)水平最高,各治疗组血清TSLP水平显著降低,对照组小鼠血清TSLP (3.36±2.71pg/ml)水平最低,显著低于其他4组(P<0.01)。10、哮喘组小鼠灌洗液TSLP(27.84±6.08 pg/ml)水平最高,与其他各组有显著差异(P<0.01)。各治疗组灌洗液TSLP水平显著降低,对照组小鼠灌洗液TSLP(3.11±2.11pg/ml)水平最低。11、血清TSLP值与灌洗液TSLP值进行比值,各组比值之间未发现显著差异。12、小鼠支气管肺泡灌洗液的IL-4浓度均数水平从高到低依次是哮喘组、替米沙坦组、罗格列酮组、地塞米松组、对照组。对照组IL-4浓度最低,与其他组有显著差异(P<0.05)。哮喘组显著高于罗格列酮组、地塞米松组、对照组,有统计学意义(P<0.05),与替米沙坦组之间无显著差异(P=0.070)。地塞米松组、罗格列酮组、替米沙坦组之间无显著差异(P>0.05)13、小鼠支气管肺泡灌洗液的INF-γ均数水平从高到低依次是替米沙坦组、罗格列酮组、对照组、地塞米松组、哮喘组。统计学分析显示罗格列酮组显著高于哮喘组,有统计学差异(P=0.036)。其他各组之间相互比较无统计学差异(P>0.05)结论1、本研究首次证明了哮喘患者血浆及诱导痰TSLP表达明显增加,而且与肺功能显著负相关。随着病情程度的增加,血浆及诱导痰TSLP表达明显增加,在重度哮喘病人增加最显著。2、血浆中TSLP水平与诱导痰中TSLP水平显著相关,提示循环中TSLP水平可能作为哮喘监控新的指标。3、诱导痰中TSLP水平与嗜酸性粒细胞百分数及绝对计数显著正相关。4、随着Poly I:C刺激时间的增加TSLP mRNA的表达先升高,后下降。3h后表达最高。25gg/m1的Poly I:C刺激并不引起PPAR-γmRNA的表达增加。5、罗格列酮、替米沙坦、GW9662对正常状态下16HBE TSLP mRNA和蛋白的无显著影响。但是PPAR-γ激动剂罗格列酮、替米沙坦可以抑制Poly I:C诱导的16HBE TSLP基因和蛋白的表达,这种抑制作用能够被PPAR-γ拮抗剂GW9662所拮抗,提示罗格列酮、替米沙坦通过PPAR-γ通路发挥这种抑制作用。6、NF-κB抑制剂Bay 11-7082能够抑制Poly I:C诱导的16HBE TSLP基因的表达,提示抑制NF-κB通路可以抑制TSLP的表达。7、哮喘小鼠气道上皮细胞高表达TSLP, PPAR-γ激动剂罗格列酮、替米沙坦可以抑制哮喘小鼠气道上皮细胞TSLP的表达,降低哮喘小鼠的气道炎症及气道高反应性,降低Th2型细胞因子IL-4分泌和肺泡灌洗液的嗜酸细胞数量,提示罗格列酮、替米沙坦可能通过抑制’TSLP的表达来调控哮喘气道炎症的。8、PPAR-γ激动剂罗格列酮、替米沙坦可以抑制哮喘小鼠气道上皮细胞的NF-κB活性,结合细胞学实验提示可能通过抑制NF-κB活性来调控TSLP的表达。