内源性抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要组成成分,防御素(defensins)是其中一大家族。β-防御素是防御素家族中的的重要成员,它主要分布于哺乳动物和鸟类的粘膜上皮组织内,已被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。因目前未见有关羊雌性生殖道防御素的研究报道。也未见生殖道防御素表达和雌激素、孕激素关系的研究报道。本文系统研究了蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的表达情况,并系统研究了生殖道β-防御素的表达和雌激素、孕激素的关系。结果如下:1运用RT-PCR技术,首次从蒙古绵羊雌性生殖道各器官中证实,β-防御素(sBD-1)在蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道粘膜上皮内均有表达。并且发现,sBD-1在雌性生殖道的各个器官内的表达量不同。其中在子宫颈的表达量最高,子宫和输卵管内的表达量次之,阴道内的表达量最少。2将蒙古绵羊输卵管组织sBD-1的RT-PCR产物回收、地高辛探针标记,应用原位杂交技术,检测sBD-1 mRNA在输卵管组织中的定位。结果显示:sBD-1 mRNA在蒙古绵羊输卵管粘膜层上皮细胞游离面的胞质内表达。sBD-1在固有层、肌层、结缔组织中无表达。符合β-防御素主要表达于黏膜表面细胞的规律。3用0.25%胰蛋白酶消化方法,成功获得了原代培养、传代培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞。经形态学、免疫组化方法鉴定,证实所培养细胞为上皮细胞。传三代细胞经染色体核型分析表明,传代培养细胞健康正常。可以作为研究输卵管上皮细胞sBD-1表达与激素关系的研究模型细胞。4为了探讨蒙古绵羊雌性生殖道sBD-1的表达量是否与雌激素、孕激素有关,本实验对培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞进行激素添加实验。传代细胞培养4d,更换无血清培养液10h,添加激素培养,运用荧光定量RT-PCR方法检测sBD-1的表达情况。结果显示:(1)添加10-8 M,10-9 M ,10-10 M 17-β-雌二醇组均与对照组有极显著差异,而10-11 M17-β-雌二醇组与对照组无显著性差异。添加17-β-雌二醇情况下,不同培养时间对sBD-1的表达量无显著性影响。一定浓度的17-β-雌二醇对sBD-1表达有促进作用。(2)添加10-6 M,10-7 M孕酮组与对照组有显著性差异,10-8 M,10-9 M孕酮组与对照组差异极显著,10-11 M孕酮组与对照组无显著性差异。一定浓度的孕酮对培养的输卵管上皮细胞sBD-1的表达有促进作用。(3)模拟发情期激素浓度组(添加10-8 M 17-β-雌二醇,10-9 M孕酮)与对照组有极显著差异,模拟妊娠期激素浓度组(添加10-10 M 17-β-雌二醇, 10-7 M孕酮)与对照组有显著差异。17-β-雌二醇和孕酮混合添加对sBD-1表达也有促进作用;因此雌性生殖道防御素的表达与雌性动物的生理周期有关。由此说明,雌激素和孕激素是防御素表达的促进因素之一,但是不是防御素表达的必需因素。5为了进一步探讨雌激素、孕激素对雌性生殖道β-防御素表达的促进作用机理,培养的输卵管上皮细胞在添加雌激素拮抗剂他莫昔芬和孕激素拮抗剂米非司酮处理后,继续添加相应浓度的雌激素、孕激素,运用荧光定量RT-PCR方法检测sBD-1表达情况。结果显示,添加10-6 M他莫昔芬作用一定时间之后,再添加10-8 M 17-β-雌二醇对sBD-1表达没有促进作用;而添加10-6 M米非司酮一定时间之后,再添加10-8 M孕酮对sBD-1表达也不产生影响。雌激素、孕激素对β-防御素表达的促进作用是通过与相应的雌激素受体和孕激素受体结合实现的。