大果水晶梨及其褐色果皮突变体pal基因克隆及表达分析

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大果水晶梨褐色果皮突变体与大果水晶梨原品种相比,在果皮表面有一层木栓层。木栓层中的木质素是苯丙烷类代谢途径产生的酚类化合物的聚合物。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代谢过程中的第一个关键酶。因此,研究pal基因对于探索大果水晶梨褐色果皮突变体的形成具有重要意义。以大果水晶梨及其褐色果皮突变体的叶片为材料提取DNA,分别以原品种和突变体的DNA为模板克隆pal。分别在幼果期(果点、果皮均未变褐)、果点变褐期、果皮变褐期和采收期采取果实样品,测定果皮PAL的活性、蛋白质含量、比活力及其pal的基因表达。结果如下:在果实幼果期、果点变褐期和果皮变褐期突变体果皮中的PAL活性和蛋白含量略高于原品种。在果点变褐期和果皮变褐期,大果水晶梨突变体果皮的PAL比活力均高于原品种。分别以大果水晶梨及其褐色果皮突变体叶片的DNA为模板,使用引物Ⅰ克隆得到大果水晶梨及其突变体的pal1的基因片段,序列分析表明两者没有差异。以3对简并引物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别克隆得到大果水晶梨及其褐色果皮突变体的pal2基因的片段。利用DNAMAN软件对序列进行拼接,得到2414bp的大果水晶梨pal2序列,其中外显子1997bp,内含子417bp;翻译得到的氨基酸序列由665个氨基酸组成。得到2411bp的大果水晶梨突变体的pal2序列,其中外显子2001bp,内含子410bp;翻译得到的氨基酸序列包含666个氨基酸。大果水晶梨pal2的内含子长于突变体的7bp。大果水晶梨及其褐色果皮突变体在不同时期的pal表达结果显示,大果水晶梨pal1的表达量在各个时期均高于突变体,表明pal1与果皮变褐呈负相关的趋势。而大果水晶梨pal2的表达量在果点变褐期、果皮变褐期、采收期均低于突变体,表明pal2与果皮变褐呈正相关的趋势。根据序列分析和定量表达的结果,推测大果水晶梨突变体pal2的内含子由于碱基的突变或内含子长度变短,导致调控元件的积极响应,是引起PAL的表达增强,使得木质素含量增加,导致褐色果皮形成的原因之一。
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