本论文的主要研究内容包括两个方面:1.通过农杆菌转化法将拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1导入猕猴桃基因组,PCR初步筛选得到假定转基因植株并经过分子生物学检测和生理功能的验证。2.通过Nothern杂交的方法验证不同环境影响因子下At4G12490的反应特征,以确定该基因在逆境下的功能。　　 1.农杆菌介导的猕猴桃转化及AtNHX1转化植株抗盐性分析　　 猕猴桃起源于中国,因风味独特、营养价值高、富含多种有益健康成分和潜在的药用前景而倍受关注。作为一种新型商业化水果,猕猴桃在水果市场中影响小但重要性日益增长。近年来,随着生活水平的提高和消费结构的变化,人们对优质猕猴桃的需求越来越大。我国丰富的猕猴桃种质资源是新品种选育的基础,但猕猴桃属植物雌雄异株,遗传背景复杂,传统育种方法存在周期长、效率低等问题。现代生物技术的兴起为猕猴桃育种开辟了一条新的途径。随着猕猴桃组织培养的发展,通过遗传转化方法导入目的基因已成为猕猴桃育种的重要手段。本实验选用全国栽种面积最大、产量最高的美味猕猴桃作为研究对象,在猕猴桃的高频再生体系的基础上,采用农杆菌转化法将拟南芥AtNHX1基因转入猕猴桃,并对转化植株做了分子生物学鉴定及生理学检测。具体工作如下:　　 农杆菌介导的猕猴桃遗传转化。用携带pHZX1质粒的农杆菌菌株LBA4404侵染猕猴桃愈伤组织、茎切段和叶切片,在附加600mg/L水解酪蛋白、20mg/L卡那霉和500mg/L头孢霉素的MS培养基上诱导愈伤组织和植株再生。含1.0mg/LIBA的MS培养基用来生根。　　 猕猴桃遗传转化体系的优化。探讨不同外植体类型、预培养、农杆菌侵染时间、共培养时间、农杆菌浓度及乙酰丁香酮对猕猴桃转化的影响。猕猴桃茎比叶更适于农杆菌转化。叶片预培养1-2天的转化频率会显著增加,而预培养不会提高茎的转化率,预培养4天后转化率反而会下降。农杆菌侵染、浓度时间及共培养时间对转化的影响很关键。叶片的合适侵染时间是2分钟,茎段为15分钟。2天共培养时间对茎及叶片都是合适的。适宜农杆菌浓度能明显促进侵染,同时减少其对外植体的伤害。相比茎(最佳OD600=0.6),叶片需要低浓度菌液(最佳OD600=0.2)。　　 猕猴桃转化体的分子生物学检测。从4株PCR阳性植株均扩增得到560bpAtNHX1基因片段,其中3个株系被用来做Southern杂交分析。TL1与TL2含单拷贝AtNHX1,然而TL3有2拷贝。在TL1与TL2中,反转录PCR结果表明该基因在转录水平上表达。　　 猕猴桃转化体的生理学检测。对两个转基因株系TL1与TL2进行了生理分析以评价其抗盐性。一般条件下,Na+、K+含量在转基因植株及对照中相同；在高盐条件(200mmol/1)下,转基因植株中Na+、K+含量明显高于对照。植物在逆境下会产生大量的游离脯氨酸进行渗透调节,往往发生膜脂过氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物。经盐胁迫3天后,转基因株系自由脯氨酸含量高于对照；转基因株系中丙二醛含量均低于对照。这些数据证明Na+/H+反向转运蛋白在抗盐胁迫中的作用,AtNHX1基因的表达与缓解Na+毒害作用是相关联的。　　 盐胁迫条件下,转基因植株营养生长明显改善。转基因株系(TL1,TL2)及对照转入土壤中生长2周,用含0-200 mmol/L,NaCl溶液浇灌20天,可观察到明显的抑制效果；野生型植株叶片逐渐变黄、萎蔫,然而转基因植株仍然保持绿色,且生长正常。盐胁迫条件下,转基因株系比对照在营养生长阶段生长量有明显的提高。150mmol/L NaCl处理转基因株系及对照20天,对照芽鲜重为未处理31％,转基因株系TL1为未处理77％,后者比前者比对照高2倍多。　　 黄酮是猕猴桃中重要的营养成分,是植物的次生代谢产物,参与阻止细胞老化,拮抗ROS。不同猕猴桃组织中黄酮含量不同,大体上有以下规律:叶片＞茎＞根。在盐胁迫处理后,转基因株系黄酮含量高于对照,TL1和TL2分别比对照高71％、40％,叶片黄酮含量分别比对照高68％、44％,这就进一步确定转基因株系有较强的抗氧化能力,这些结果与MDA含量变化相吻合。　　 2.At4G12490对逆境的抗性功能研究　　 植物不断受到环境中各种信号的冲击,其中部分会造成胁迫,影响植物的生长及发育。在应对这些不良逆境过程中进化出许多策略增加对胁迫条件的耐受性和适应性,例如改变基因表达特征,导至整个细胞或系统水平的适应应答。多个报道表明HyPRP基因表达受多种胁迫因素的诱导,但是这些研究仅限于单个或少数基因。拟南芥的At4G12490是拟南芥.EARLI1亚家族(HyPRP基因家族)中的一员。在本工作中,我们以.At4G12490的功能作为研究目标。　　 At4G12490可被多种胁迫因素诱导。4℃处理拟南芥2h后At4G12490的mRNA水平缓慢增加,16h mRNA累积到最强。种子苗4℃处理24h.,然后置于25℃室温下611后At4G12490的mRNA降至较低水平,24h后恢复至基态水平。16h冷处理能最大强度激活At4G12490的表达,但恢复至常温后这种稳态并不能长久保持。没有冷诱导的条件下,长日照种子苗中At4G12490 mRNA基本水平略高于短日照种子苗。可能该基因是光依赖的,并且冷激活该基因也需要光的辅助。盐胁迫是影响植物生长的重要因素之一,发现盐可诱导At4G12490表达。拟南芥受到胁迫三天之内,盐胁迫缓慢的激活At4G12490,24h该基因表达水平明显升高,72h达到最大。干旱胁迫下,随胁迫时间的延长At4G12490 mRNA水平逐渐增高。处理12h后RNA累积达最高点,这表明At4G12490可被干旱胁迫激活。水杨酸胁迫可诱导At4G12490。水杨酸(SA)是一种重要的信号分子,与植物抗病性有关,应答不同病原体侵袭；另外,水杨酸也参与调节植物对各种氧化胁迫的反应。在24h内,At4G12490的RNA表达水平在处理0-16h后增加缓慢,而且RNA的积累的量处于很低的水平上,24h达到峰值。这些结果证明SA作为一种防御信号,能激活At4G12490 RNA的表达,证明At4g12490参与植物病原体防御及胁迫耐受性。　　 At4G12490过表达增加拟南芥在盐及干旱胁迫下根的生长。利用At4G12490过表达植株研究该基因对拟南芥生理的影响,发现在盐及干旱胁迫下过表达植株萌发率低于Co1-0,而根长伸长高于Co1-0。这些结果表明过表达植株具有一定程度的抗旱和抗盐能力,然而Co1-0种子萌发率超过过表达植株,这可能要归因于过表达该基因引起的负面效应。