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花烛(Anthurium andraeanum Lind.)为天南星科(Araceae)花烛属多年生附生性常绿草本植物,极具观赏价值,其盆花和切花深受国内外消费者的喜爱。本实验室在花烛品种‘Sonate’离体培养过程中获得了一个叶色深绿突变体,与野生型相比,深绿突变体的叶片颜色更深,佛焰苞颜色也由原来的粉红色变为红色。其叶片、叶柄、佛焰苞的花青素含量也存在显著差异。因此,野生型与深绿突变体是研究花烛花青素代谢的理想材料。花青素是植物重要的次生代谢产物,其代谢受多种结构基因及转录因子的影响和调控。为了在分子水平分析花烛花青素代谢机理,本研究以花烛品种‘Sonate’野生型(Wild-type plant)和深绿突变体(Dark green mutant)为试验材料,通过转录组测序技术,寻找与花烛花青素代谢、调控相关的差异表达基因,对差异表达基因进行克隆和序列分析,并通过转基因手段分析其功能,从而揭示花烛品种‘Sonate’野生型与深绿突变体花青素含量差异和叶色差异的原因。具体研究结果如下:1.对花烛品种‘Sonate’野生型和深绿突变体进行花青素含量测定及转录组测序分析。结果显示,在整个叶片发育阶段,深绿突变体叶片的花青素含量均高于野生型,且在早期与野生型差异显著,野生型叶片整体呈黄色调,而深绿突变体叶片整体呈红色调。转录组测序共获得68179个Unigene,其中24035个Unigene获得功能注释。对花烛花青素代谢、转运、调控相关的基因进行分析,其花青素生物合成的结构基因均获得注释,证明花烛品种‘Sonate’叶片内花青素合成途径完整。与花青素相关的转运基因和调控基因也获得注释。2.以花烛品种‘Sonate’野生型和深绿突变体叶片转录组数据库为基础,进行差异表达基因的分析。共筛选出2161个差异表达基因,与野生型相比,其基因表达水平在深绿突变体中上调的有1085个,下调的有1076个。共1253个差异表达基因获得了功能注释。在所有差异表达基因中,有11个花青素合成基因在深绿突变体叶片内显著上调。与花青素代谢相关的三类转录因子MYB、bHLH、WD40中,各有3个MYB类和bHLH类转录因子显著上调。在所有与花烛花青素代谢和调控相关的差异表达基因中,F3’H、bHLH35、bHLH51可能是造成野生型和深绿突变体花青素含量差异及叶色差异的关键基因。3.以转录组数据中预测的Unigene CDS序列为参考,对三个差异表达基因F3’H、bHLH35、bHLH51进行基因克隆、序列分析、表达载体构建及农杆菌转化。克隆得到的AaF3’H,基因CDS序列全长1536 bp,编码512个氨基酸,AabHLH35基因CDS序列全长765 bp,编码255个氨基酸,AabHLH51基因CDS序列全长774 bp,编码258个氨基酸。保守结构域分析发现,AabHLH35与AabHLH51基因序列中均存在bHLH结构域与ACT结构域。因此可以确定AabHLH35与AabHLH51是bHLH家族转录因子,且能与MYB类转录因子形成MBW复合物。4.通过农杆菌蘸花法将AaF3’H、AabHLH35基因转入拟南芥以确定基因功能。转AabHLH35基因的拟南芥T1代的种子种皮颜色变深,T2代植株的莲座叶叶柄及花序轴基部的颜色也明显加深呈紫色,而转AaF3’H基因的株系则无类似表型。较野生型相比,AabHLH35转基因株系T2代花青素含量升高3倍且差异显著,其与花青素合成相关内源基因的表达水平也均有不同程度的升高。证明AabHLH35基因与花青素代谢相关,是花青素代谢的正调控转录因子,能促进花青素的积累。结合AabHLH35基因在深绿突变体中显著上调的表达水平,分析认为,AabHLH35基因是花烛品种‘Sonate’野生型和深绿突变体花青素含量差异及叶色差异的主要原因之一。