论文部分内容阅读
目的:研究新鱼腥草素钠(Sodium new houttuyfonate,SNH)联合顺铂(Cisplatin,CDDP)对非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用,探讨两药联用抗肺癌的可能机制。采用薄膜分散法制备新鱼腥草素钠与顺铂共载脂质体(Sodium new houttuyfonate-Cisplatin-Liposomes,SNH-CDDP-Lp)并进行药代动力学考察,为临床非小细胞肺癌的联合化疗提供新的思路。方法:釆用MTT法检测SNH与CDDP单用或联用后对A549细胞增殖的抑制情况,并筛选出最佳联用比例。通过流式细胞仪探讨各给药组对A549细胞凋亡及周期的影响。运用Western Blot技术和QPCR技术分别从蛋白和基因水平研究各给药组诱导A549细胞凋亡的机制。急性毒性实验考察SNH和CDDP的毒性。建立裸鼠荷瘤模型,考察各给药组体内抑瘤效果。薄膜分散法制备SNH-CDDP-Lp,并通过响应面法对处方进行优化。利用粒径仪测定粒径与Zeta电位。透射电镜观察SNH-CDDP-Lp的形貌。建立高效液相色谱法(High performance liquid chromatograph,HPLC)测定SNH-CDDP-Lp中SNH和CDDP的包封率和总载药量。动态透析法考察SNH-CDDP-Lp在含1.0%吐温80的生理盐水溶液中的体外累积释放率,并对SNH-CDDP-Lp稳定性进行考察。以SD大鼠为模型,考察SNH-CDDP-Lp的药代动力学特征,采用HPLC法测定SNH和CDDP的血药浓度,绘制药-时曲线,DAS 3.2.8软件计算和分析药代动力学参数。结果:SNH作用于A549细胞24、48、72 h的IC50值均高于CDDP,SNH作用于A549细胞24、48、72 h的IC50值分别为(42.39±2.86)、(29.08±0.22)、(16.21±0.78)μg/m L,CDDP作用于A549细胞24、48、72 h的IC50值分别为(8.95±0.67)、(3.03±0.11)、(1.08±0.09)μg/m L。SNH和CDDP联用比例为4:1时,各给药组的联合用药指数(Combined index,CI)均小于1,其中10μg/m L SNH+2.5μg/m L CDDP组CI值为0.84,抑制率为(54.68±0.88)μg/m L。与Control组相比,SNH组、CDDP组、SNH+CDDP组的凋亡率均升高,分别为(17.10±1.05)、(45.67±1.33)、(59.07±4.60)μg/m L,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Control组相比,SNH组G0/G1期细胞比例增加21.23%,S期减少19.03%,CDDP组和SNH+CDDP组G0/G1期分别减少6.74%、20.07%(P<0.01),S期分别增加9.77%、24.17%(P<0.01)。与Control组相比,其余三组均能升高Bax、P53、Cleaved-Caspase3蛋白和基因的表达水平(P<0.05),均能降低Bcl-2、Caspase3蛋白和基因的表达水平(P<0.05)。此外,CDDP组未观察到NF-κB蛋白和基因表达的明显下调,SNH组和SNH+CDDP组可见明显下调。SNH组昆明组小鼠LD50值为166.7mg/kg,CDDP组昆明组小鼠LD50值为13.1mg/kg,SNH+CDDP组昆明组小鼠LD50值为213.2mg/kg+16.8mg/kg。体内抑瘤实验结果表明SNH+CDDPL组和SNH+CDDPH组的抑瘤效果均大于单药组。与其他组相比,SNH+CDDPH组的抑瘤率最高,呈现为79.72%,SNH+CDDPL组的抑瘤率和CDDPH组接近,分别为66.67%和69.32%。CDDPL组和CDDPH组裸鼠体重持续下降,其余给药组中裸鼠的体重缓慢增加。制备的SNH和CDDP共载脂质体的最优处方为:PEG质量分数为4.92%、药脂比为24.04:1、磷脂和胆固醇比例为3.70:1。平均粒径为(112.40±1.30)nm,PDI为0.188±0.004,Zeta电位为(-34.0±0.10)m V。透射电镜下脂质体呈类球形,分布均匀。SNH-CDDP-LP中SNH和CDDP的包封率分别为(89.43±0.91)%和(92.30±1.08)%,总载药量为(12.25±0.09)%。SNH-CDDP-LP中SNH和CDDP累积释放率分别为(58.58±1.97)%和(62.66±3.56)%。高温和强光照条件下脂质体中SNH和CDDP的包封率和总载药量均明显下降。4℃条件下放置90 d,脂质体中SNH和CDDP的包封率和总载药量基本保持不变。室温条件下放置90d,SNH和CDDP的包封率和总载药量逐渐下降。药代动力学实验结果表明与SNH-CDDP-SOL(Sodium new houttuyfonate-Cisplatin-Solution,SNH-CDDP-SOL)组相比,SNH-CDDP-LP组AUC和T1/2均显著增大。SNH-CDDP-LP的AUC 0-t:LP-SNH是SOL-SNH的7.53倍,LP-CDDP是SOL-CDDP的5.70倍;SNH-CDDP-LP的T1/2:LP-SNH是SOL-SNH的1.62倍,LP-CDDP是SOL-CDDP的1.93倍。结论:CDDP抑制A549细胞增殖能力强于SNH,但CDDP的细胞毒性大于SNH,两药联用可以增强抗肺癌活性,并且联用比例为4:1时,协同效果最好。SNH+CDDP联用组诱导细胞凋亡能力强于单用药组。SNH和CDDP分别阻滞于细胞周期的不同阶段,阻止m RNA、蛋白质的合成以及DNA的复制,导致细胞无法完成正常分裂,诱导细胞凋亡。SNH和CDDP诱导细胞凋亡的机制可能与调控NF-κB和凋亡两条信号通路相关蛋白和基因的表达有关。与SNH组、CDDP组相比,SNH+CDDP组毒性较低,SNH和CDDP联用可以增强体内抑瘤效果,并且可以在维持疗效的同时减少CDDP剂量,降低不良反应。制备的SNH与CDDP共载脂质体包封率符合要求,具有一定缓释效果,可以改善两药的药代动力学过程,按比例释放药物,显著提高两药在大鼠体内的生物利用度。