生长分化因子5（Growth differentiation factor5，GDF5）又称软骨形态发生蛋白-1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）或骨形态发生蛋白14(bonemorphogenetic protein14，BMP14)，是转化生长因子β（transforming growthfactor-beta，TGF-β）超家族中的一员。GDF5作为机体软骨形成、骨骼发育的重要调节因子之一，近年来受到了广泛的研究与关注。人GDF5基因定位于20q11.2，全长488 kb，编码501个氨基酸，由位于N端的信号肽、中间的前体肽以及C端的成熟肽三个部分构成。GDF5第377-381位氨基酸残基(RRKRR)为前蛋白转化酶作用位点，前体单肽链合成后将通过二硫键形成同源二聚体或与其他BMP家族成员形成异源二聚体，而后N端前体蛋白被切除并释放出C端成熟蛋白，并分泌到细胞外后发挥其生物学作用。　　 GDF5是软骨和骨骼形成的重要调节因子，主要表达于胚胎早期的软骨聚集区、软骨膜以及关节区间域。在骨骼发育初期，GDF5可以促进软骨细胞在一定部位的聚集与粘附，而后期则能够刺激软骨细胞的增生与肥大。GDF5基因突变可以引起多种类型的骨骼发育不良疾病，近端指（趾）骨间关节粘连（Proximal symphalangism，SYM1）就是其中一种。SYM1是一种罕见的常染色体显性遗传病，主要由GDF5或其抑制基因NOG突变引起，以肢端骨骼融合和短指（趾）为主要表型，病变多发生于近节指骨和中指骨处，表现为近节指骨变长、中指骨变短、关节腔狭窄，使近节指骨关节不能曲伸或曲伸受限，常累及第3、4和5指，还可伴有耳聋、视力发育异常等其他症状。　　 本课题组在前期收集的一个中国汉族SYM1的家系中确定其致病原因为GDF5c.1118T＞G(p.L373R)突变，迄今为止文献报道的能够引起SYM1的GDF5突变共有五种:R438L、E491K、N445K/T和L373R，其中E491K、L373R为中国家系突变，L373R为本课题组首次报道的突变。该突变位于GDF5前体蛋白转化酶作用位点附近，在不同种属之间具有很高的保守性。为了明确GDF5-L373R突变的致病方式和途径，我们构建了多种表达载体，研究了野生型和突变型GDF5前体蛋白水解效率、成熟蛋白分泌表达量以及软骨/骨发育信号通路中相关信号分子的改变，以探讨揭示GDF5-L373R致病新突变导致SYM1的可能作用机制。　　 材料方法　　 一、GDF5-L373R突变对GDF5蛋白表达的影响　　 敲除信号肽的野生型和突变型GDF5真核表达载体(peDNA3.1-GDF5-WTdelsp和peDNA3.1-GDF5-L373Rdelsp)转染COS-7细胞。48小时后提取细胞总蛋白，Western Blot检测GDF5前体蛋白和GDF5成熟蛋白表达量的变化，并计算成熟蛋白占前体蛋白的百分比数。　　 二、GD F5-L373R突变对GDF5蛋白与其受体结合能力的影响　　 野生型和突变型GDF5真核表达载体(pcDNA3.1-GDF5-WT和pcDNA3.1-GDF5-L373R)转染HEK-293细胞。48小时后提取细胞总蛋白，采用免疫沉淀技术将细胞裂解液与GDF5抗体共孵育，通过Western Blot检测GDF5蛋白与受体BMPRIB结合能力的变化。　　 三、GDF5-L373R突变对与软骨/骨发育相关通路因子的影响　　 野生型和突变型GDF5慢病毒表达载体(LV-GDF5-WT和LV-GDF5-L373R)感染ATDC-5细胞。感染3-4天后，采用RT-PCR和Western Blot技术分别在RNA和蛋白质水平上检测GDF5、ALP、ColⅡ、p-Smad1/5/8、Smurf1以及ID1的变化。　　 四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片检测GDF5-L373R突变后相关基因的差异表达　　 野生型和突变型GDF5真核表达载体转染ATDC-5细胞。48小时后以Trizol收集细胞，由上海康成生物公司进行TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCRArray芯片检测。　　 五、GDF5-L373R突变蛋白亚细胞定位的研究　　 分别以pDsRed1-N1-GDF5-WT、pDsRed1-N1-GDF5-L373R载体和pDsRed1-N1空载体转染HEK-293细胞。转染继续培养72小时后，荧光显微镜下观察比较各实验组间荧光分布情况。　　 实验结果　　 一、GDF5-L373R突变导致GDF5成熟蛋白表达降低vWestern Blot检测结果显示:与野生型相比GDF5-L373R突变后导致GDF5前体蛋白和成熟蛋白表达均明显降低，但是其成熟蛋白占前体蛋白的百分数比值却升高，推测突变可能导致GDF5前体蛋白有效的水解作用上调。　　 二、G DF5-L373R突变导致GDF5蛋白与其受体结合能力下调　　 采用免疫沉淀技术，通过Western Blot检测GDF5与受体BMPRIB的结合能力，结果显示GDF5-L373R突变导致GDF5蛋白与BMPRIB结合能力下调。　　 三、GDF5-L373R突变对与软骨/骨发育相关信号通路因子的影响　　 在RNA和蛋白质水平上检测了相关骨/软骨发育信号通路中因子的变化，结果显示GDF5-L373R突变后在RNA水平上检测到Gdf5表达下调、Alp表达上调;在蛋白质水平上检测到p-Smad1/5/8和ID1表达下调;Smurf1和ColⅡ表达上调。　　 四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片检测GDF5-L373R突变后相关基因的差异表达　　 基因芯片共检测了TGF-β/BMP信号通路中84个相关通路因子，我们重点关注了前期检测的Smad信号通路中的相关因子，经验证基本与我们前期实验结果相符。此外，我们还观察到了p21的差异表达，通过Western Blot在蛋白水平上检测到突变后p21表达下调，提示GDF5-373R突变后可能会对细胞增殖能力产生影响。　　 五、GDF5-L373R突变蛋白亚细胞定位的研究　　 经荧光共聚焦显微镜观察，结果显示野生型和突变型GDF5蛋白质均定位于细胞浆，没有检测到其在细胞核的定位。　　 结论：　　 GDF5-L373R突变由于减弱了与BMPRIB结合能力而使细胞内p-Smad1/5/8表达减少， ID1表达降低，ColⅡ表达增加，影响了Smad信号通路下游相关因子的表达，导致软骨细胞特征持续表达，关节形成缺陷，导致SYM1表型。