研究背景和目的肺癌是目前世界上发病率和死亡率第一的恶性肿瘤,严重威胁人们的身体健康。非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer, NSCLC)是肺癌中最主要的病理类型,占发病率的80-85%,其中恶性程度最高的是肺腺癌,早期即可发生血行转移。肺癌发病早期缺乏有效的检查方法,患者早期无任何症状,多为查体发现,大部分出现症状的患者多为中、晚期。早期肺癌可以通过手术切除,中晚期患者主要依靠放、化疗。紫杉醇是目前非小细胞肺癌化疗的一线用药,紫杉醇是短叶红豆杉提取物的主要活性成分,是一种微管稳定剂,作用于肿瘤细胞后,能促进微管蛋白(tubulin)聚合形成微管结构,并保持微管结构稳定,干扰细胞纺锤体形成,进而干扰有丝分裂,导致细胞死亡。虽然紫杉醇对NSCLC具有高效的杀伤作用,但总体生存率仍较低(30-50%),这是由于肿瘤细胞对紫杉醇原发性或继发性耐药,使大多数患者在治疗初期或治疗过程中出现耐药,耐药是影响紫杉醇化疗效果的重要因素。在没有新一代更有效化疗药物出现的前提下,提高现有化疗药物的敏感性、逆转化疗药物的耐药作用,是提高NSCLC治疗效果的重要策略。紫杉醇发生耐药为多种机制,根据其作用过程,发生耐药的主要机制为：(1)紫杉醇通过细胞膜后,跨膜外排转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过表达,促进细胞内紫杉醇排除细胞,降低药物浓度,使紫杉醇无法达到杀伤细胞的阈值。P-gp是ATP结合盒(ATP Binding Cassette,ABC)家族重要成员,由ABCB1基因编码。(2)微管网络中的紫杉醇结合位点发生突变或异常,包括α微管蛋白和β微管蛋白,紫杉醇无法与微管蛋白结合,微管蛋白聚合功能丧失。(3)细胞死亡途径中的凋亡蛋白表达下调,包括Bcl-2、P53等,不能正常传导细胞死亡信号。对于紫杉醇耐药逆转的研究,目前尚无突破性进展,并且因药物毒性未能应用于临床。中药制剂因其多靶点高疗效的抗肿瘤作用,目前成为抗肿瘤作用机制研究的一个突破点。雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是中国传统中药雷公藤(Tripterygium wilfordii)中的主要活性成分,为一种双萜类化合物。研究证实TPL具有多种生物活性,包括免疫抑制、抗炎及抗肿瘤作用,特别在抗肿瘤领域具有良好的应用前景,在白血病治疗方面TPL已进入Ⅰ期临床实验阶段。目前大量研究证实雷公藤甲素对多种肿瘤细胞具有抑制作用,例如乳腺癌、消化道肿瘤、前列腺癌及神经系统肿瘤等。自从1972年雷公藤甲素被发现,学者们对其作用的分子机制进行了深入研究,如TPL发挥免疫调节作用方面,主要是通过抑制核转录因子NF-κB减少炎性因子的产生而减弱机体的免疫反应；在抗肿瘤作用方面,TPL能诱导多种肿瘤细胞凋亡,主要是通过抑制HSF1(heat shock factor 1)、API(activator protein 1)、NF-κB等多种转录调控因子发挥抗肿瘤作用。这说明NF-κB可能是TPL发挥其生物活性的重要基础。Denis等发现,抑制肿瘤细胞的RNA聚合酶Ⅱ的转录也是雷公藤甲素发挥抗肿瘤作用的重要潜在机制之一。核转录因子kappa B(NF-κB)是转录机制中重要的一组蛋白质,是一种具有多种调节能力的核转录因子,最早于1986年被Sen等从小鼠B淋巴细胞的细胞核中提取发现,生物机体中最重要转录激活因子,广泛存在于各种真核细胞中。NF-κB参与多种生理过程、多种细胞因子的调节,在多种细胞进程中发挥作用,包括应激、细胞因子基因表达、自由基、细胞粘附、细胞周期激活、凋亡和肿瘤形成,是重要的核转录调控因子。在正常细胞中,大部分的NF-κB在细胞质中与其抑制因子IκBα、IκBβ、IκBε中的一个结合,形成无活性的NF-κB/I-κB复合物,存在于细胞胞浆中。TNF-α通过细胞膜受体传递信号,逐渐激活TNF-α受体相关的因子TRAF等,激活NF-κB诱导激酶NIK、I-κB激活激酶IKK,IKK使I-κB磷酸化被蛋白酶降解,NF-κB/I-κB复合物解体,释放游离的NF-κB转移至细胞核内,调节靶基因的转录,这些被调控的基因包括与耐药相关的基因,如抗凋亡基因Bcl-2、XIAP等。此外,研究表明多药耐药基因ABCB1的转录也受NF-κB调控,应用基因转染技术证实NF-κB结合位点位于ABCB1的上游基因,ABCB1为NF-κB的下游基因。NF-κB能调控ABCB1编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达,有研究表明抑制人结直肠腺癌细胞HCT15中NF-κB表达能导致ABCB1编码的P-gp表达下调,而后者证实与紫杉醇耐药有直接关系,所以NF-κB在紫杉醇耐药中具有重要作用,是紫杉醇耐药的重要转录调控因子。真核生物的转录机制非常复杂,除了转录调控因子的参与,还需要多种蛋白因子参与协助,另一个重要的因子是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,PolⅡ)。最近的研究进一步发现TPL对肿瘤细胞具有广泛的转录抑制作用,TPL可以广泛抑制非小细胞肺癌A549细胞的RNA(包括总RNA、mRNA)合成；TPL作用后A549细胞98%的基因表达下调,特别是一些短周期(short-lived)的转录因子、细胞周期调控因子(CDC25A)、原癌基因(Myc、Src)的表达显著下调。TPL这一作用主要依赖于其抑制RNA polymerase Ⅱ (Pol Ⅱ)的功能。以往的研究中表明TPL可能具有多药耐药逆转作用,如Chen等发现TPL可以抑制耐药的人口腔癌KB肿瘤细胞的多药耐药基因(multidrug resistance 1, MDR1)的表达,并增加5-FU的化疗敏感性；Li等发现TPL通过抑制miR-21表达以及上调PTEN水平,提高阿霉素耐药的人白血病K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。这些证据说明TPL可能具有潜在的耐药逆转作用,但其分子机理尚不清楚。并且对于紫杉醇耐药的肺癌,TPL的作用目前尚无相关研究。因此,我们提出TPL通过抑制NF-κB信号通路及RNA聚合酶Ⅱ两个关键靶点,抑制广谱的耐药基因的转录,进而发挥耐药逆转作用的假说。本研究将探讨TPL对人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol的细胞凋亡及细胞周期的影响,从分子机制方面研究TPL对肺腺癌紫杉醇耐药逆转作用,阐明TPL对肺腺癌紫杉醇耐药的逆转作用及其机制,本研究的结果将对NSCLC紫杉醇化疗耐药逆转剂的进一步研究提供理论依据。材料和方法第一部分雷公藤甲素对人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol的影响一、建立人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol采用人肺腺癌细胞A549紫杉醇浓度梯度法建立耐药细胞株A549/Taxol。取对数生长期的A549细胞加入RPMI-1640培养基,RPMI-1640培养基中加入10%胎牛血清,加入100U/ml青霉素,加入100μg/ml链霉素,在37℃5%CO2环境下培养。紫杉醇从最小浓度20ng/ml开始加入培养基中,在该环境下培养细胞24小时,紫杉醇诱导敏感细胞凋亡,存活的A549细胞继续在无紫杉醇的培养基中培养至对数生长期。下一个循环周期中,继续应用同样方法培养A549细胞,紫杉醇浓度从20ng/ml加至400ng/ml(浓度梯度20,40,60,80,100,120,200,300,400 ng/ml),重复该过程直至A549细胞在400ng/ml紫杉醇培养基中稳定生长,存活的A549细胞就是紫杉醇耐药的人肺腺癌细胞A549/Taxol。测定耐药指数(RI)=IC50 (A549/T)/IC50 (A549)=51.87。二、TPL对A549/Taxol细胞凋亡的影响Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡。取对数生长期的A549/Taxol细胞,接种于六孔板中,培养24小时,待细胞贴壁后,根据治疗组的设置,分别加入不同浓度的TPL(0.03,0.3,3 μmol/L),同时设立阴性对照组；分别作用2,4,6,12h后,用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次,然后离心2000rpm,5min,收集5×105细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀；室温、避光、反应5～15min；用流式细胞仪检测(Ex=488 nm; Em=530 nm)细胞凋亡的情况。三、TPL对A549/Taxol细胞周期的影响PI单染法检测细胞周期。取对数生长期的A549/Taxol细胞,将其接种到六孔板中,培养至第二天,待细胞贴壁后,根据不同的组别设置,分别加入相应的含药培养基,同时设立阴性对照组；待药物作用48小时后,用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞；用PBS洗涤细胞一次,离心2000rpm,5min,收集细胞5×105；用体积分数为70%的乙醇固定收集制备的细胞悬液2小时(或过夜),在4℃条件下保存,用PBS洗去固定液后再进行染色；力100μL RNase A37℃水浴30min；再加入400μLPI染色混匀,4℃避光30min；上流式细胞仪进行检测,记录激发波长488nm处的红色荧光。第二部分：TPL对A549/Taxol细胞NF-κB信号通路及其介导的耐药相关基因表达的抑制一、TPL对A549/Taxol细胞中NFκB的表达和细胞核转移的影响1、Western-blot用常规方法提取细胞总蛋白,用BCA法测定蛋白的浓度,取40ug蛋白,95-100℃加热5min使蛋白充分变性后,样品置于冰上冷却,标本上样到SDS-PAGE加样孔中,进行SDS-PAGE电泳。电泳条件：浓缩胶恒压80V约20min,分离胶100V约80min。剪裁滤纸并准备PVDF膜(使用前于无水甲醇中浸泡),将凝胶取出,保留分离胶,培养皿中加入转移缓冲液,将胶、PVDF膜、滤纸放入转移缓冲液中充分平衡15min。湿电转移：平放底部的阳极石墨电极,依次在电极上放置滤纸、PVDF膜、凝胶和缓冲液浸泡过的滤纸,形成复合夹物层,小心去除各层中的气泡,在夹层物上方放置阴性电极,并用滤纸吸取多余缓冲液。调整恒流电为200mA,通电进行转膜1小时。转膜后进行封闭：封闭液为5%脱脂奶粉配置,将PVDF膜放入封闭液中,在室温条件、水平摇床上封闭1小时,吸弃封闭液。加入封闭液(约0.1mL/cm2)、加入适量的一抗抗体CK19(1：5000),β-actin抗体(1：4000)。摇床摇荡孵育(4℃,过夜)。PBST漂洗滤膜4次,每次5min。配制二抗,用辣根过氧化酶(HRP)进行标记,封闭液稀释1：5000,将PVDF膜加入配制的二抗,在室温条件下摇床荡孵育1-2小时,用PBST充分洗膜5次,每次5min。计算显影液量(0.1mL/cm2),加入显影液于PVDF膜上,放置在室温下1分钟。PVDF膜放在保鲜膜上包好,暗室中将X光片贴在PVDF膜上,进行曝光,曝光完将X光片浸入显影液中显影(1-2分钟),出现清晰的最佳条带后,再浸入定影液中定影,时间5-10分钟,至胶片透明。水洗残留定影液后晾干。2、免疫荧光TPL处理细胞后孵箱培养细胞爬片,将细胞爬片自然晾干,固定液用4%的多聚甲醛,将爬片浸入固定液中30分钟,改善细胞的渗透性,用PBS浸洗爬片三次,每次3分钟；用3%H202-甲醇溶液在每张爬片上滴加2滴,室温条件下封闭10分钟(15-25℃),用PBS浸洗玻片3次,每次3分钟,吸干液体。玻片上滴加即用型山羊血清50-100ul,在室温条件下孵育20分钟。滴加一抗(1：200稀释)50-100u1,37℃,湿盒孵育2小时,PBS浸洗3次。滴加FITC/TRITC(1：200稀释)二抗50-100ul,37℃,避光孵育1h; PBS浸洗3次。染核：滴加配制的DAPI染液50-100ul在每张玻片上进行染核,室温避光孵育5分钟。PBST浸洗多余染液,吸干玻片上的液体,用抗荧光萃灭剂封片胶进行封片。然后在荧光显微镜下观察,注意观察细胞中蛋白的表达,取三个蛋白高表达区域进行拍照,保存。二、TPL对A549/Taxol细胞RNA聚合酶Ⅱ的影响Wstern blot检测TPL作用于人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol后,A549/Taxol细胞中Rpbl的表达情况。(Western blot实验方法同上)三、TPL对A549/Taxol细胞凋亡相关基因FLIP、XIAP、Bcl-2、Bcl-xL、 COX-2表达的影响Wstern blot检测TPL作用于人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol后,凋亡相关基因FLIP、XIAP、Bcl-2、Bcl-xL、COX-2表达的情况。(Western blot实验方法同上)结果第一部分雷公藤甲素对人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol的影响1、建立人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol用浓度梯度法培养人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol,测定耐药指数(RI)=IC50(A549/T)/IC50 (A549)=51.87。2、流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示TPL能诱导A549/Taxol细胞凋亡,这种作用是时间-剂量依赖关系。3、流式细胞术检测细胞周期,结果显示TPL能调节A549/Taxol细胞周期,使细胞周期阻滞于S/G2期,进而使肿瘤细胞死亡。第二部分：TPL对A549/Taxol细胞NF-κB信号通路及其介导的耐药相关基因表达的抑制1、TPL能抑制A549/Taxol细胞NF-κB转移至细胞核内,能抑制NF-κB的表达。2、TPL能抑制RNA聚合酶Ⅱ最大的亚单位Rpb1的表达。3、TPL能抑制NF-κB调控的下游凋亡相关基因FLIP、XIAP、Bcl-2、Bcl-xL、 COX-2的表达。结论1、TPL能诱导人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol凋亡,说明TPL对人肺腺癌紫杉醇耐药细胞具有耐药逆转作用。2、TPL能抑制人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol核转录因子NF-κB进行细胞核内转移,能抑制RNA聚合酶Ⅱ的功能。说明TPL对人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol基因转录功能具有抑制作用。3、TPL能抑制凋亡相关基因FLIP、XIAP、Bcl-2、Bcl-xL、COX-2的表达。说明TPL对耐药相关基因表达具有抑制作用。4、TPL通过抑制NF-κB信号通路及RNA聚合酶Ⅱ的功能,进而抑制广谱的耐药基因转录,发挥耐药逆转作用。