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溃疡性结肠炎(UC)的发病与多种因素有关,其中以免疫、遗传、感染及环境等因素为主,免疫因素在UC的发病中起重要作用。目前关于UC发病机制尚不明确,对其机制的研究主要集中在免疫分子和炎症介质等领域,尤其是NF-κB通路的研究,正逐步揭示着UC的发病机制。通过作用于该通路的IκBα IKKβ等关键分子,进而抑制核因子-κB(NF-κB)的活化,抑制UC肠道的免疫和炎症反应已成为当前抗UC研究的热点。研究还发现环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、髓过氧化物酶(MPO)、白介素-10(IL-10)等与NF-κB通路密切相关。COX-2、NOS、MPO在UC肠道的炎症反应中起促进作用,而IL-10在UC肠道的炎症反应中起抑制作用。中医药在UC的治疗上疗效显著,且没有西药副作用大及复发率高等不足,但其作用机制研究较少开展,限制了中医药治疗水平的提高。在前期溃结灵对UC大鼠结肠黏膜NF-κB活化有明显抑制作用的基础上,本研究进一步观察其对UC大鼠模型NF-κB通路的关键分子IKBα和IKK β以及与该通路密切相关的COX-2、iNOS、IL-10等的影响,探讨溃结灵治疗UC作用的深层次机理,为高质量的抗UC中药新药的开发打下基础。1溃结灵对UC大鼠结肠黏膜组织IκBα、IKKβ蛋白表达的作用IκBα、IKKβ蛋白是NF-κB通路的重要成员,在NF-κB活化过程中发挥着重要作用。本研究采用溃结灵三个剂量(18.3g/kg、9.2g/kg、4.6g/kg)对三硝基苯磺酸(TNBS)法复制的UC大鼠模型进行治疗,治疗结束后取结肠组织固定,制备病理切片,进行免疫组化染色,光镜下计数阳性细胞百分率,并进行统计学分析。结果表明模型组结肠黏膜组织中IκBα蛋白阳性细胞表达率为47.86+16.52%,明显低于正常组82.91±28.00%(P<0.01)；溃结灵中、低剂量组IκBα蛋白阳性细胞表达率分别为70.57±21.26%、69.37±25.23%,均明显高于模型组(P<0.05)。另外模型组结肠黏膜组织中IKKβ蛋白阳性细胞表达率为69.15±19.45%,明显高于正常组44.74±16.32%(P<0.05)；溃结灵中剂量组IKK β蛋白阳性细胞表达率为49.79±18.52%,明显高于模型组(P<0.05)。提示溃结灵能明显升高TNBS法UC大鼠模型结肠黏膜组织中IκBα蛋白阳性细胞表达率,降低UC大鼠模型结肠黏膜组织中IKKβ蛋白阳性细胞表达率。2溃结灵对UC大鼠结肠黏膜组织COX-2蛋白表达的作用正常结肠黏膜组织不表达COX-2,在炎症粘膜上皮细胞及结肠固有层单核炎性细胞中则有表达,COX-2表达与UC病情严重程度呈正相关。研究表明COX-2的表达可以调节NF-κβ通路。本实验分组和治疗同前述,治疗结束后采集结肠黏膜标本并提取全细胞蛋白,采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测结肠黏膜组织中COX-2蛋白表达水平,以β-actin作为内参,以目的蛋白与β-actin密度的比值作为目的蛋白的相对含量,进行组间比较分析。结果表明模型组结肠黏膜组织中COX-2蛋白相对表达量为1.189±0.498,明显高于正常组0.639±0.334(P<0.05)；溃结灵高、中、低剂量组结肠黏膜组织中COX-2蛋白相对表达量分别为0.651±0.428、0.643±0.426、0.599±0.340,明显低于模型组1.189±0.498(P<0.05)。提示溃结灵对TNBS法UC大鼠结肠黏膜组织中COX-2蛋白表达有抑制作用。3溃结灵对UC大鼠结肠黏膜组织iNOS、 MPO活性的影响一氧化氮合酶(NOS)是合成NO的关键酶,NO合成过量可促进炎症反应。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是NOS的同工酶之一,此酶参与合成的NO释放量大,持续时间长。目前许多研究表明iNOS与UC的发病关系密切,UC时NO主要由iNOS产生。iNOS在基因转录水平受到NF-κB调控。MPO是一种重要的过氧化物酶,MPO含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高,间接反映炎症在组织中的存在。本研究通过观察溃结灵对UC大鼠结肠黏膜组织iNOS、 MPO活性的影响,对其作用机制进行初步探讨。分组和治疗同前述,治疗结束后采集结肠黏膜标本并提取全细胞蛋白,采用生化试剂盒法检测结肠黏膜组织中iNOS、 MPO活性,并进行统计学分析。结果表明模型组结肠黏膜组织中iNOS活性为4.407±1.448U/mgprot,明显高于正常组2.530±0.424U/mgprot(P<0.01);溃结灵高、中剂量组iNOS活性分别为3.105±1.121U/mgprot、2.945±0.656U/mgprot,明显低于模型组(P<0.05)。另外模型组结肠黏膜组织中MPO活力为0.960±0.558单位/克湿片,明显高于正常组0.455±0.365单位/克湿片(P<0.05)；溃结灵高、中剂量组MPO活性分别为0.348±0.194单位／克湿片、0.513±0.219单位/克湿片,明显低于模型组(P<0.01,P<0.05)。提示溃结灵能够降低UC大鼠结肠黏膜组织中iNOS、 MPO活性。4溃结灵对UC大鼠结肠黏膜中IL-10的作用细胞因子在UC的发病及进展中起重要的作用,促炎因子和抑炎因子的失衡是溃疡性结肠炎发生发展的重要因素。NF-κB调控着UC患者细胞因子的释放,它们在UC的发病及进展中关系密切。本研究分组和治疗同前述,治疗结束后采集结肠黏膜标本,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测结肠黏膜组织中IL-10的含量,并进行统计学分析。结果表明模型组结肠黏膜组织中IL-10的含量为10.494±3.410ng/L,明显高于正常组3.952±1.277ng/L(P<0.01)；溃结灵高剂量组结肠黏膜组织中IL-10的含量为16.123±3.607ng/L,明显大于模型组(P<0.01)。提示UC大鼠结肠黏膜组织中IL-10的含量是逐渐递增的,同时表明溃结灵能够提高UC大鼠结肠黏膜中抑炎细胞因子IL-10的含量。总之,NF-κB通路在UC发病发展过程中具有举足轻重的地位,其活化过程及作用机制与许多细胞因子和炎症介质有关。COX-2、 iNOS、 MPO等是影响NF-κB活化的重要分子,与NF-κ活化程度呈正相关,在NF-κB活化的过程中起促进作用。而IL-10为抑炎细胞因子,可以抑制NF-κB的活化,其过程可能是通过抑制IKK的激活,阻碍IκBα的降解,进而抑制NF-κB的活性,降低细胞因子的表达,终止UC肠道的免疫和炎症反应等。临床研究证实COX-2、iNOS、MPO与UC的发病有密切的关系,其在炎症黏膜中的过度表达与UC结肠黏膜的炎症程度成正相关。而IL-10已被确定为UC的易感基因。本研究选用临床经验方溃结灵治疗TNBS法制备的UC大鼠模型,治疗后结肠黏膜组织中IκBα蛋白阳性细胞率明显升高,IKKβ蛋白阳性细胞率明显降低,结肠黏膜组织中COX-2蛋白表达明显降低,结肠黏膜组织中iNOS、MPO活性降低,血中IL-10的含量明显升高。表明溃结灵能提高UC大鼠结肠黏膜IκBα蛋白表达,降低IKKβ蛋白表达,对COX-2/iNOS/MPO均具有抑制作用,对IL-10具有促进作用,这可能是其抑制NF-KB活化进而治疗UC的部分作用机理。