论文部分内容阅读
研究背景与目的动脉粥样硬化所致的缺血性疾病(包括缺血性心脏病、缺血性脑卒中和外周动脉疾病等)严重危害中老年人的健康。尽管药物治疗和介入治疗取得了巨大进展,但对于急性心肌梗死和冠心病三支血管病变不适合冠脉介入治疗患者,促进缺血心肌血管生成,改善心肌供血,对于缓解临床症状、提高心功能和改善预后具有重要意义。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,具有血管生成的先天优势,因此,通过促进EPCs血管生成和改善组织供血而被广泛用于细胞移植治疗缺血性心脏病和外周动脉粥样硬化性疾病的研究。然而,由于这些组织多存在严重的缺血缺氧的微环境,不利于细胞生存和发挥作用,致使大部分移植细胞发生凋亡或死亡。因此,如何调节和促进移植的EPCs在缺血组织的生存具有重要研究意义。核因子相关因子-2(Nrf2)是机体抗氧化反应的重要因子,其激活后可以诱导下游多种抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录和表达,从而发挥抗氧化应激的保护作用。基础研究表明,缺血缺氧组织中存在严重的炎症反应和氧化应激反应,这是促使移植细胞发生凋亡和坏死的最重要因素。而Nrf2是否涉及移植细胞在缺血缺氧微环境的生存调节及其具体机制尚不清楚。缺氧预处理可以增强多种细胞移植治疗的疗效和功能,Nrf2是否涉及这一过程以及机制如何,亦不清楚。因此,本研究拟应用密度梯度离心加贴壁培养法获得骨髓源EPCs,运用分子生物学技术使该EPCs过表达Nrf2或降低Nrf2表达,再给予不同缺氧条件下预处理,通过体内外实验观察不同缺氧条件下EPCs的生物学特性改变、血管生成能力及其与Nrf2的关系,探讨分析Nrf2对缺氧预处理后EPCs的细胞生存、在血管生成中的作用的影响及其机制。研究方法1.内皮祖细胞培养及其生物学特性通过密度梯度离心加贴壁培养法从大鼠骨髓获得骨髓源EPCs,通过培养细胞生长形态、细胞内吞试验和流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记三个方法鉴定培养细胞为epcs。2.nrf2在缺氧预处理的epcs中的表达及促血管生成作用与机制研究将epcs分为四组:1)对照组;2)epcs-nrf2-sirna组;3)epcs-con-sirna组;4)epcs-nrf2组。根据实验目的不同,给予相应缺氧预处理,并进行如下实验:1)应用荧光探针dcfh-da试剂盒检测细胞内ros水平;2)采用annexinv/pi双染色后行流式细胞仪检测细胞凋亡水平;3)应用mtt法检测细胞增殖能力;4)应用细胞划痕试验检测细胞迁移能力;5)应用elisa法测定细胞培养基中hif-1α和vegf水平,评价细胞旁分泌功能;6)应用激光共聚焦检测缺氧诱导的nrf2核转位情况;7)应用荧光实时定量rt-pcr和westernblot检测缺氧诱导的信号通路激活情况以及nrf2与其下游靶基因转录和蛋白表达情况。3.nrf2在epcs血管生成中的作用及机制体外实验:应用tubeformation试验观察缺氧诱导的上述四组细胞血管生成能力;体内实验:建立心肌梗死大鼠模型,并根据移植细胞不同,即epcs、epcs-nrf2-sirna、epcs-con-sirna和epcs-nrf2,相应分为四组:1)对照组;2)epcs-nrf2-sirna组;3)epcs-con-sirna组;4)epcs-nrf2组。细胞移植采用心肌梗死交界区直接注射细胞方法。应用免疫荧光染色观察不同移植细胞组28d时细胞存活和局部细胞凋亡情况;应用cd31免疫组化染色观察局部血管生成情况。实验结果1)密度梯度离心加贴壁培养法可以获得较大数量和高纯度的epcs。2)应用细胞内吞试验和流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记cd34、cd133、kdr和cd31,证明培养细胞为目的细胞epcs。3)缺氧诱导epcs产生ros,并激活nrf2核内转位。4)sirna干扰nrf2后加重缺氧诱导细胞凋亡,并抑制细胞增殖能力,并降低细胞迁移能力;而高表达nrf2抑制缺氧诱导的细胞凋亡,增强细胞迁移能力,但对细胞增殖能力无影响,这些结果表明,nrf2有利于维持缺氧微环境中的细胞生存。同时,nrf2正性调节缺氧诱导的epcs旁分泌功能。5)缺氧通过激活细胞PI3K/Akt信号途径而促进Nrf2表达增加,进而诱导细胞中HO-1和NQO1 m RNA转录和蛋白表达。6)缺氧诱导EPCs形成胶管样结构;siRNA干扰Nrf2显著降低缺氧诱导的EPCs胶管形成能力;在心肌梗死大鼠模型中,si RNA干扰Nrf2显著减少移植EPCs的生存,伴随着心肌梗死交界区毛细血管数目减少;过表达Nrf2则显著促进移植EPCs的生存,增加心肌梗死交界区毛细血管毛细血管数目。研究结论1)密度梯度离心加贴壁培养法可以获得较大数量和高纯度的EPCs;细胞内吞试验和细胞表面抗原标记CD34、CD133、KDR和CD31鉴定证实为EPCs。2)siRNA干扰Nrf2后加重缺氧诱导细胞凋亡,并抑制细胞增殖能力,降低细胞迁移能力;而高表达Nrf2抑制缺氧诱导的细胞凋亡,增强细胞迁移能力,但对细胞增殖能力无影响,这些结果表明,Nrf2有利于维持缺氧微环境中的细胞生存。同时,Nrf2正性调节缺氧预处理的EPCs的旁分泌功能。3)胶管形成试验和动物在体心肌梗死模型实验显示,Nrf2参与缺氧诱导的血管生成作用。这个可能是EPCs-Nrf2较EPCs移植治疗具有更好改善心功能的原因。4)缺氧诱导EPCs产生ROS,并激活Nrf2核内转位。5)缺氧通过激活细胞PI3K/Akt信号途径而诱导Nrf2表达增加,而Nrf2激活并转位于细胞核内促进HO-1和NQO1 m RNA转录和蛋白表达。