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内毒素又称脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性细菌外膜的主要成分。内毒素血症及由此引起的急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)、急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory dysfunction syndrome, ARDS）和多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome, MODS）是病人感染死亡的重要原因。在LPS所致肺急性炎症反应的研究中，既往多注重肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AM）和多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte, PMN）在诱发和调节炎症反应中的作用。而对肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cells, ATⅡcells）的研究却较少。事实上，ATⅡcell象AM和PMN一样，也能被LPS强烈激活，释放大量炎症介质，对急性肺损伤的发生、发展同样起着不可忽视的作用。Toll样受体4（Toll like receptor-4, TLR4）及其附属蛋白MD2，控制着LPS炎症信号进入细胞内的通路，ATⅡcells是否表达TLR4和MD2受体，以及它们在LPS激活ATⅡcells的过程中有何作用尚不清楚。本研究探讨TLR4及MD2在LPS激活ATⅡcells中的作用及其机制，以期为急性肺损伤的防治提供新的思路。方法：（1）通过RT-PCR的方法检测TLR4及MD2 mRNA在ATⅡcells的表达；通过EMSA检测LPS刺激后的ATⅡcells NF-κB活性的变化；ELISA检测ATⅡcells培养上清中TNF-α和IL-6的含量变化。（2）应用PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段，分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点，构建TLR4及MD2基因的反义真核表达载体，并对其进行酶切和测序鉴定。（3）采用脂质体转染试剂将反义载体转染入培养的ATⅡcells。Northern blot检测TLR4及MD2 mRNA表达；Western blot检测TLR4及MD2 蛋白表达；EMSA检测转染后的ATⅡcells NF-κB活性的变化；ELISA检测转染后的ATⅡcells培养上清中TNF-α和IL-6的含量变化。结果：（1）正常未刺激细胞即可见TLR4和MD2 mRNA表达。1 ng/ml LPS刺激2 h后即可引起TLR4和MD2 mRNA表达显著增高（P＜0.01），此后随着LPS浓度的增高，表达继续增强，当LPS浓度达到103 ng/ml以上时，继续增加LPS浓度，TLR4和MD2 mRNA表达虽仍有增多，但无显著变化。103 ng/ml LPS刺激后1 h，TLR4和MD2 mRNA<WP=9>表达明显增强（P＜0.01），2 h至4 h达到高峰，之后明显下降。（2）LPS刺激后，NF-κΒ活性在不同时相点均较对照组显著升高(P<0.001)，LPS作用1 h后其活性开始升高，2～4 h达到峰值，随后逐渐减弱。不同浓度 LPS刺激后，各组细胞NF-κΒ活性与对照组相比均显著升高(P<0.001)，而且随着LPS浓度的增加，NF-κΒ活性呈浓度依赖性的增强。（3）LPS刺激后，各时相点细胞培养上清中TNF-α和IL-6的含量均显著高于正常对照组（P＜0.01）；TNF-α在LPS刺激后的1 h内即迅速升高，2 h左右达到高峰，随后迅速下降，但仍显著高于对照组；IL-6在LPS刺激后缓慢升高，4 h后迅速升高，8 h左右达到高峰，随后缓慢下降。经不同浓度LPS作用2 h后，各组细胞培养上清中TNF-α和IL-6的含量均显著高于正常对照组（P＜0.01），但IL-6升高的幅度要低于TNF-α；LPS引起TNF-α和IL-6的增加呈浓度依赖性。（4）经酶切鉴定及测序分析，证实TLR4和MD2反义真核表达载体构建成功。经Northern blot和Western blot证实TLR4和MD2反义基因成功转染入ATⅡcells。（5）LPS刺激后的未转染及转染空载体的细胞TLR4及MD2 mRNA和蛋白的表达较未刺激细胞明显增强（P＜0.01）；转染重组体的细胞与未转染组及空载体组相比，其mRNA和蛋白的表达明显减弱（P＜0.01）。（6）经LPS刺激的未转染及转染空载体的细胞与未刺激细胞相比，NF-κB活性、TNF-α和IL-6的含量均显著增加（P＜0.01）；经LPS刺激后，转染重组体的细胞与未转染组及转染空载体组相比，NF-κB活性及TNF-α和IL-6的含量明显降低（P＜0.01）；同时转染TLR4-MD2及单独转染MD2反义基因的细胞与单独转染TLR4反义基因的细胞相比，NF-κB活性及TNF-α和IL-6的含量显著下降（P＜0.05）。结论：（1）正常ATⅡcells表达有TLR4和MD2 mRNA，LPS刺激后表达增强；其表达在1 ng~103 ng/ml LPS范围内呈浓度依赖性增强。（2）LPS刺激后，ATⅡcells NF-κB活性呈浓度依赖性的增强，TNF-α和IL-6的生成也呈浓度依赖性的增加。（3）成功构建TLR4和MD2反义真核表达载体，并成功转染入培养的ATⅡcell。（4）TLR4和MD2反义基因能抑制各自的mRNA和蛋白表达，并抑制LPS诱导的ATⅡcells NF-κB活性的增强及TNF-α和IL-6生成的增加。以上结论明确了TLR4和MD2在LPS激活ATⅡcells中的作用，并为急性肺损伤的防治提供了新的思路。