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目的:脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病,其中以缺血性脑血管疾病最常见,具有高致残率、高死亡率、高发病率、高复发率等特点,对该病的防治及研究是当今医学界的热点之一。星形胶质细胞上广泛存在的缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)能传递细胞间的物质和信息,对脑损伤后的扩散以及修复都有促进作用。Cx43受到碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的影响,bFGF是一种具有广泛生物活性的神经营养因子,主要由星形胶质细胞产生,能促进神经元的生长和突触可塑性,维持中枢神经系统功能。补阳还五汤是中医治疗脑缺血的代表方,具有补气活血、化瘀通络之功效。现代研究表明补阳还五汤可以在脑缺血后不同时间段对Cx43的表达进行调节,并且在脑缺血恢复期维持bFGF的高水平表达,促进脑损伤后神经功能的修复。神经功能的恢复与神经重塑密切相关,而突触是神经重塑最强的部位,许多神经系统的功能都依靠于突触可塑性的参与,突触素(synaptophysin,SYN)和生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)是与突触可塑性密切相关的蛋白,它们的表达量与突触结构可塑性密切相关。深入了解突触可塑性调控机制有利于了解突触重建的全过程,对揭示学习、记忆的分子机制以及神经可塑性相关疾病的预防和治疗具有重要意义。因此,本实验运用透射电镜观察缺血后脑海马的突触超微结构,采用免疫荧光联合免疫蛋白印迹分析与突触重塑机制密切相关的蛋白表达情况,探讨补阳还五汤通过Cx43在脑缺血损伤后的恢复期促进神经重塑的机制。方法:选取雄性SD成年大鼠(250-300g),采用改良线栓法,创建大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,术后进行神经功能评分,选取评分合格的大鼠进行下面实验。1.Cx43在脑缺血再灌注损伤后修复中的作用大鼠分别在术后3、7、14 d取材,使用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测不同时间点Cx43和p-Cx43的表达情况。大鼠随机分为MCAO组、Cx43抑制剂(Gap26)组、Cx43激动剂(GAP-134)组;Gap26于术后第3d腹腔注射,1次/d(25μg/kg),GAP-134于术后第3d灌胃,2次/d(3mg/kg),假手术和模型组用生理盐水处理;术后7 d取材,分别观察脑缺血损伤后,海马区突触结构的形态,数目,使用WB分别检测缺血侧脑海马区SYN、GAP-43的表达。运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)对各组海马CA1、CA3、DG区SYN、GAP-43的表达进行定位检测。2.Cx43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注损伤后修复中的作用大鼠随机分为MCAO组、BYHWD组、BYHWD联合Gap26组,补阳还五汤于术后清醒灌胃2次/d(16g/kg),Gap26于术后第3d腹腔注射,1次/d(25μg/kg),假手术和模型组用生理盐水处理;术后7 d取材,WB检测缺血侧海马SYN、GAP-43的表达。IF对各组海马CA1、CA3、DG区SYN、GAP-43的表达进行检测。3.Cx43在bFGF促进脑缺血再灌注损伤后修复中的作用大鼠随机分为MCAO组、bFGF组、bFGF中和抗体组、bFGF联合Gap26组、BYHWD组、BYHWD联合bFGF中和抗体组,bFGF于术后第3d腹腔注射,1次/d(100μg/kg),bFGF中和抗体于术后第3d灌胃,1次/d(0.1mg/kg),Gap26于术后第3d腹腔注射,1次/d(25μg/kg),补阳还五汤于术后清醒灌胃2次/d(16g/kg),假手术和模型组用生理盐水处理;术后7d取材,WB检测缺血侧海马Cx43、FGFR1的表达。IF对海马FGFR1和GFAP进行双染。IF对各组海马CA1、CA3、DG区SYN、GAP-43的表达进行检测。结果:1.免疫蛋白印迹检测术后不同时间点Cx43和p-Cx43蛋白表达情况,结果显示大鼠脑缺血再灌注后第3d、7d、14 d,Cx43和p-Cx43表达均增加(P<0.05)。此外,第7d蛋白表达水平明显高于3d和14d(P<0.05),是表达高峰期。电镜下观察到假手术组的突触结构完整,突触轮廓清晰,有较多的突触数量以及均匀分布的突触小泡;模型组和Gap26组突触结构溶解,突触轮廓模糊,突触以及突触小泡数量明显减少;GAP-134组突触结构较完整,突触轮廓较清晰,突触数量明显增多;WB和IF显示:与假手术比较,模型组SYN、GAP-43的表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,Gap26组显著降低SYN、GAP-43的表达(P<0.05);GAP-134组显著升高SYN、GAP-43的表达(P<0.05)。2.电镜下观察到补阳还五汤明显改善了损伤的突触,相比于突触结构溶解,突触数量减少的模型组,补阳还五汤组的突触结构较完整,突触轮廓较清晰,突触数量增多,接近正常;补阳还五汤联合Gap26组突触损伤较补阳还五汤组加重。WB和IF显示:与假手术比较,模型组的SYN、GAP-43表达情况显著升高(P<0.05);补阳还五汤组SYN、GAP-43的表达与模型组比较显著增强(P<0.05);与补阳还五汤联合Gap26组比较,补阳还五汤增强SYN、GAP-43的作用被显著抑制(P<0.05)。3.与假手术比较,模型组Cx43的表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,bFGF组可显著增强Cx43的表达(P<0.05);与补阳还五汤组比较,补阳还五汤联合bFGF中和组显著降低Cx43的表达(P<0.05)。与模型组比较,bFGF组可显著增强SYN、GAP-43 的表达(P<0.05);与 bFGF 组比较,bFGF+Gap26 组显著降低 SYN、GAP-43的表达(P<0.05)。结论:1.在脑缺血再灌注恢复期,Cx43能促进缺血侧海马突触可塑性,其机制可能与调节SYN和GAP-43的表达有关;2.在脑缺血再灌注恢复期,补阳还五汤能促进缺血侧海马区的突触可塑性,其机制可能与增加Cx43的表达促进对SYN和GAP-43的干预有关;3.在脑缺血再灌注恢复期,补阳还五汤能通过bFGF增强Cx43的表达,bFGF促进缺血侧海马突触可塑性的机制可能与通过Cx43干预SYN和GAP-43的表达有关。