端粒是染色体末端的特殊结构,具有保护染色体和维持基因组稳定性的能力。而肿瘤细胞中端粒长度在有丝分裂过程中维持稳定,则是肿瘤细胞逃避衰老及程序性死亡并持续增殖的主要原因之一。近年来的研究证据表明,核不均一核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNPA1）在肿瘤细胞染色体末端中具有重要的端粒功能。除了帮助端粒酶维持端粒的有效长度外,它还可以帮助复制蛋白A（Replication protein A,RPA）与端粒单链DNA解离,从而促进端粒保护蛋白1（Protection of telomeres 1,POT1）包裹端粒单链DNA,并有效避免端粒单链DNA粘性末端的暴露和DNA损伤反应（DNA damage reaction,DDR）的异常激活,最终避免染色体融合后所导致的基因组稳定性下降。课题组前期研究发现脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子（apurinic apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1,APE1）可以在M期通过激活DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs）磷酸化hnRNPA1。hnRNPA1的磷酸化水平是决定其与端粒单链DNA亲和力和竞争性抑制RPA的主要因素[1]。同时,我们也发现POT1不能直接被募集至端粒单链DNA并取代hnRNPA1完成端粒戴帽。因此,我们推测hnRNPA1可能被某种磷酸酶去磷酸化,该过程帮助hnRNPA1从端粒单链DNA上解离并且促进POT1与端粒ss DNA的结合。并且推测该磷酸酶是端粒保护调控通路的关键限速酶。抑制该磷酸酶可通过破坏端粒结构而导致基因组不稳定性,具有增加细胞放射敏感性的潜在作用[2]。此外,我们发现放疗导致的氧化应激会通过APE1对肿瘤微环境中免疫细胞发挥作用。基于上述依据提示APE1与磷酸酶可能具有协同放疗增敏的作用。主要的研究内容和研究结果如下:1.磷酸酶PP2A是作用于hnRNPA1的磷酸酶,且作用于hnRNPA1的Ser-95和Ser-192位点。通过蛋白组学质谱分析寻找与hnRNPA1模拟磷酸化突变体,以及与模拟去磷酸化突变蛋体相互作用的磷酸酶。发现磷酸酶PP2A的结构亚基PPP2R1A与hnRNPA1相互作用,且随磷酸化水平而变化。且进一步的实验也证实PPP2R1A是磷酸酶PP2A发挥生物学效应的基础。随后通过研究敲低PPP2R1A后hnRNPA1上游通路的激活情况,证实hnRNPA1是磷酸酶PP2A的直接底物,并通过hnRNPA模拟去磷酸化突变蛋白证实Ser-95和Ser-192位点是PP2A的作用位点。2.hnRNPA1在M期的磷酸化水平,先后受到DNA-PKcs磷酸化与PP2A去磷酸化的顺序调控,这种动态过程有利于hnRNPA1从端粒DNA上解离。通过PLA实验对比不同细胞周期中PPP2R1A与hnRNPA1的亲和力变化,发现M晚期PPP2R1A与hnRNPA1结合最高,随后通过CO-IP实验证实在M期两者的结合随着时间延长而增加,结合前期研究成果证明在M期hnRNPA1的磷酸化水平受到激酶和磷酸酶的动态调控。3.PP2A依赖的hnRNPA1去磷酸化可以促进POT1结合并保护端粒DNA通过体外端粒ss DNA亲和实验发现:敲低PPP2R1A后,端粒ss DNA上POT1替换RPA的能力降低,且通过免疫荧光证实敲低PPP2R1A同样可以降低端粒ss DNA上募集POT1的能力。结果证明PP2A是磷酸化APE1/DNA-PKcs/hnRNPA1调控轴的关键限速酶。4.PP2A有助于TERRA表达水平在M期特异性再积累。TERRA在细胞中的表达随细胞周期变化,且该变化可以帮助hnRNPA1在M期的募集,我们通过q RT-PCR发现磷酸酶PP2A有助于TERRA表达水平在M期特异性增高,高表达的TERRA能螯合游离的hnRNPA1帮助POT1与端粒ss DNA的结合。该结果证明PP2A还可以通过TERRA对APE1/DNA-PKcs/hnRNPA1调控轴发挥限制作用。5.PP2A亚基PPP2R1A在有丝分裂期中具有端粒保护作用。通过免疫印迹发现敲低PPP2R1A后会导致ATR相关DNA损伤通路激活,并发现端粒处存在DNA损伤信号γH2AX,最后通过端粒荧光原位杂交发现敲低PPP2R1A后会导致端粒畸形的增加。结果证明,PPP2R1A相关的hnRNPA1去磷酸化可以维持基因组稳定性。6.PPP2R1A具有诊断及预后评估价值且抑制后可增强放射敏感性。通过生物信息学分析,发现PPP2R1A在肿瘤细胞中高表达,并在临床病理标本中进一步发现,PPP2R1A的表达随肿瘤临床TNM分期的增加而增加,具有预后预测的潜力。同时进一步通过克隆形成实验发现,敲低PPP2R1A可以增强放射敏感性。7.放疗后的肿瘤微环境氧化应激可以诱导APE1依赖性M2巨噬细胞焦亡放疗可以在直接杀伤肿瘤细胞的同时对肿瘤微环境造成氧化应激,而APE1作为氧化应激反应蛋白很有可能在肿瘤微环境中参与该机制,我们发现在氧化应激下,APE1在M2巨噬细胞中发挥促进细胞焦亡的作用。并通过Elisa、EMSA等实验方法发现APE1通过转录因子NF-κB促进NLRP3炎性小体的组装,并最终导致M2巨噬细胞焦亡。综上所述,本研究发现,磷酸酶PP2A在肿瘤细胞有丝分裂过程中是APE1/DNA-PKcs/hnRNPA1调控轴的关键限速酶,并发挥端粒保护作用。PP2A可以直接作用于hnRNPA1的Ser-95及Ser-192位点,可通过去磷酸化hnRNPA1帮助hnRNPA1从端粒单链DNA上解离,并可募集端粒保卫蛋白复合体（Shelterin）中的POT1与端粒ss DNA结合,最终发挥维持基因组稳定性的作用。我们更进一步发现PP2A具有潜在的预后预测及增加放射敏感性的作用。在研究放射敏感性的同时更发现在放疗后的氧化应激微环境中,APE1过度活化可以通过促进炎症小体的激活最终促进TAMs焦亡,削弱肿瘤免疫抑制效应。本研究首次全面地阐明肿瘤细胞中hnRNPA1磷酸化的动态变化精准地调控其对染色体末端的保护作用,并证实PP2A是APE1/DNA-PKcs/hnRNPA1调控轴的关键限速酶,更丰富了APE1在肿瘤免疫微环境中的调控机制。为今后开发以磷酸酶PP2A为靶点或与APE1联合应用的放射增敏治疗方案提供实验依据和理论基础。