加减益经颗粒处方来源于广州中医药大学第一附属医院中医妇科经验用方,临床已运用于治疗卵巢功能减退和卵巢早衰多年。全方由菟丝子、熟地黄、白芍等九味中药组成,具有补肾健脾、疏肝活血之功效。原方为汤剂,临床日服用量大,存在服用、携带、贮存不方便等缺点,不能很好地顺应现代患者的使用需要。本课题采用现代中药制剂和质量控制技术,将其开发成为携带、贮存、使用方便的颗粒剂,并对加减益经颗粒的制备工艺、质量标准、初步稳定性及药效学进行研究,为其进一步研究开发提供实验依据。目的:按照中药新药(六类)注册的相关要求和技术研究指导原则,研发一种用于防治卵巢功能减退和卵巢早衰的中药新药。方法:1.制备工艺研究(1)提取工艺研究:以金丝桃苷、芍药苷含量和固形物质量的综合评分为指标,采用单因素比较和正交试验法对影响水提工艺的加水倍量、提取次数、提取时间进行优选。(2)纯化工艺研究:以小鼠胸腺系数、脾脏系数、血清E2水平、卵巢系数为药效考察指标,比较醇沉样品与不醇沉样品的药效作用,验证是否进行醇沉工艺。(3)浓缩、干燥工艺研究:以金丝桃苷、芍药苷保留率为考察指标,比较常压、减压两种不同浓缩方法、真空干燥和喷雾干燥两种干燥方法,确定最佳浓缩、干燥工艺条件。(4)成型工艺研究:考察所得浸膏粉吸湿速率、临界相对湿度、休止角;以成型率、吸湿率、溶化率的综合评分值为评价指标,筛选填充剂;以口服顺应性为指标,优选矫味剂用量;考察干法制粒工艺条件和制剂防潮条件,并进行三批中试验证研究。2.质量标准研究依照《中国药典》2010年版及相关文献资料,采用薄层色谱法对方中菟丝子、熟地黄、白芍等进行定性鉴别研究;采用HPLC法,对君药菟丝子中金丝桃苷和臣药白芍中芍药苷进行定量研究;依照《中国药典》2010年版一部附录Ⅰ C颗粒剂项下规定,对颗粒粒度、水分、溶化性、装量差异等进行定性定量研究;采用常温和加速稳定性试验法,对上市包装条件下的三批样品进行6个月的初步稳定性考察。3.药效学研究以大鼠血清中E2、FSH、LH水平和卵巢指数为观察指标,观察加减益经颗粒自身免疫性和去势术卵巢早衰动物模型的作用效果。结果:(1)最佳提取工艺为药材提取三次,每次加8倍量水,提取1h,验证试验结果表明,该工艺稳定可行,金丝桃苷和芍药苷的平均提取率为56.96%和61.79%,干浸膏平均得率为27.60%。(2)药效学试验结果表明,与正常对照组相比模型对照组小鼠的胸腺、脾脏系数、血清E2水平、卵巢系数显著降低(P<0.01)。与模型对照组相比,醇沉前后工艺样品均明显升高小鼠胸腺系数、脾脏系数、血清E2水平、卵巢系数(P<0.05)。且不醇沉样品与醇沉后样品组间比较,不醇沉样品可显著升高雌性小鼠的胸腺系数水(P<0.05),提示多糖类成份可能对药效有一定影响,故本品无需进行醇沉。(3)提取液的最佳浓缩方式为减压浓缩,其中金丝桃苷和芍药苷的保留率分别为94.88%和93.31%;浓缩液的最佳干燥方式为真空干燥,干燥条件为60～70℃,压力为-0.085Mpa,铺盘厚度≤0.8cm,其中金丝桃苷和芍药苷保留率分别为90.98%～91.02%和 93.09%～94.17%。(4)成型工艺:浸膏粉吸湿性较强,相对临界湿度为58%,休止角为45.2°;选择麦芽糊精作为填充剂,矫味剂用量为1%的甜菊素;干法制粒控制药粉含水量在3%～5%;制成的颗粒吸湿性、流动性有所改善,其相对临界湿度为64%;包装材料选择纯铝药用复合膜。三批中试样品经检查质量均符合要求,金丝桃苷和芍药苷的转移率分别为36.46%～38.04%和46.64%～47.99%,成品收率达到90%以上。(5)质量标准:建立了加减益经颗粒质量标准,规定了熟地黄、菟丝子、白芍、柴胡、丹参五味药薄层色谱鉴别方法,规定了金丝桃苷和芍药苷的检测方法和最低含量限度。照2010版《中国药典》附录ⅠC颗粒剂项下要求,还规定了成品的性状、粒度、水分、溶化性、装量差异检查方法和判定标准;并对加减益经颗粒三批中试成品进行了 6个月常温稳定性和加速稳定性考察,产品均符合拟定的质量标准要求。(6)加减益经颗粒不同剂量组给药卵巢早衰动物模型,可升高大鼠血清E2 水平和卵巢系数,降低血清FSH和LH水平,对卵巢早衰动物模型有良好的治疗效果。结论:加减益经颗粒制备工艺合理、稳定、有效、可行、质量可控,达到了预期的研究目的,为下一步开展的工业生产和临床研究提供了实验依据。