目的分析SPOP、SIRT2及FADD在非小细胞肺癌细胞株与肺癌组织中的表达变化及其临床意义。明确SPOP分别与SIRT2和FADD相互作用,介导两者泛素化降解。通过体外实验检测SPOP介导SIRT2和FADD降解对肺癌细胞增殖的影响。方法1.Western blot检测不同非小细胞肺癌细胞株(A549、H1299、A427、Calu3)及正常支气管上皮细胞(16HBE)中SPOP和SIRT2的表达。收集非小细胞肺癌组织及配对癌旁组织,Western blot或免疫组化法检测体内SPOP、SIRT2和FADD的表达情况,并分析SIRT2及FADD表达的临床意义。2.利用基因过表达和RNA干扰上调和下调SPOP表达,用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞抑制蛋白降解。通过Co-IP、Western blot检测SPOP分别与SIRT2和FADD相互作用,介导两者泛素化,并通过26S蛋白酶体降解。3.利用cBIOPortal数据库分析非小细胞肺癌中SPOP的基因突变,通过基因过表达、Co-IP、Western blot证明SPOP在非小细胞肺癌中的基因突变影响其与SIRT2的相互作用及其介导SIRT2的降解作用。4.过表达野生型及突变型SPOP,应用体外细胞增殖实验,分析SPOP及其介导SIRT2降解对非小细胞肺癌细胞增殖的影响。5.利用基因过表达和RNA干扰上调和下调SPOP表达,分析SPOP对FADD、NF-κB活性及其下游靶基因表达的影响,检测非小细胞肺癌细胞内SPOP-FADD-NF-κB调控轴的状况。结果1.我们发现在4株非小细胞肺癌细胞(A549、H1299、A427、Calu3)中SPOP的表达显著低于正常支气管上皮细胞16HBE(P<0.05),而SIRT2的表达则显著高于16HBE细胞(P<0.05)。同时,在7例非小细胞肺癌患者的癌组织中SPOP的表达也低于其癌旁组织;而SIRT2的表达则高于癌旁组织。以上结果提示在非小细胞肺癌中SPOP与SIRT2的表达趋势相反,SPOP表达降低和SIRT2表达升高可能有利于肺癌细胞的生长。2.参照病例入选标准选取了 76例非小细胞肺癌患者进行随访分析,我们发现76例肺癌组织SIRT2表达率为90.8%(69/76),SIRT2表达水平与肿瘤分化程度无关(P=0.351);生存分析显示:SIRT2阴性或弱阳性组MST长于SIRT2中度阳性或强阳性组,两组 MST 分别为 15.0 个月(95%CI:11.742-18.258)及 13.0 个月(95%CI:10.183-15.817),差异有统计学意义(P=0.019);SIRT2表达水平是影响预后的独立因素,SIRT2 阴性或弱阳性组预后较好(HR=1.696,95%CI:1.037-2.775,P=0.035)。结果表明性别及年龄与预后无关。3.参照病例入选标准选取56例非小细胞肺癌患者进行随访分析,我们发现FADD阴性或弱阳性组的中位生存期显著长于FADD中度阳性或强阳性组(P=0.036),两组患者的中位生存期分别为16.0个月(95%CI:13.670-18.330)及12.0个月(95%CI:7.515-16.485)。采用log-rank法行单因素分析,结果显示:在性别、年龄、病理类型、分期、肿瘤分化程度及FADD表达状况6个因素中,肿瘤分化程度及FADD表达状况对预后的影响具有统计学差异(P值分别为0.003及0.036)。采用Cox回归模型分析性别、年龄及FADD表达状况3因素对预后的影响,结果表明:性别及年龄与预后无关(P值分别为0.217及0.711),FADD表达状况是影响预后的独立因素,FADD阴性或弱阳性组的中位生存期明显长于FADD中度阳性或强阳性组,差异有统计学意义(HR=1.954,95%CI:1.052-3.630,P=0.034)。4.应用未经任何处理的A549细胞的蛋白提取液,进行Co-IP检测,我们发现SIRT2和FADD可以分别与内源性SPOP被免疫共沉淀下来,说明SPOP与SIRT2和FADD存在相互作用。在A549细胞中过表达SPOP下调SIRT2和FADD的蛋白水平,而敲低SPOP则上调SIRT2和FADD的蛋白水平。用MG132处理SPOP过表达的A549细胞,结果表明SIRT2和FADD的蛋白水平得到了恢复。综合这些结果,我们证明了在A549细胞中SPOP与SIRT2和FADD相互作用,使其泛素化,通过26S蛋白酶体降解。5.FADD可以激活NF-κB通路活性,与非小细胞肺癌的不良预后相关联。通过对NF-κB活性及其下游靶点基因的检测,我们证明过表达SPOP促进FADD降解,可以下调NF-κB的活性,而敲低SPOP则使NF-κB的活性升高,同时NF-κB的靶基因包括IkBa、FAS、MCP1、A20的转录水平也因为SPOP的敲低而升高。这些结果说明非小细胞肺癌中存在SPOP-FADD-NF-κB调控轴。6.过表达SPOP显著抑制A549细胞的体外增殖,反之干扰SPOP则促进A549的增殖。SPOP的突变能够影响其功能,我们利用cBIOPortal数据库分析了 SPOP基因在非小细胞肺癌中的突变,找到5个突变位点(G75L、R121Q、G132R、G192A、K279N),前三个位于与底物相互作用的MATH结构域、后两个位于与Cul3相互作用的BTB结构域。过表达这些点突变蛋白进行细胞增殖实验,结果表明:G75L与G132R突变使SPOP丢失了对肺癌细胞增殖的抑制作用,G192A与K279N突变减弱了 SPOP对肺癌细胞增殖的抑制作用,而R121Q突变对此功能无影响。7.我们进一步分析了 SPOP在非小细胞肺癌中的突变对其降解SIRT2功能的影响。在A549细胞中分别过表达这5个位点突变的SPOP,Western blot结果表明G75L与G132R突变使SPOP丢失了对SIRT2的降解作用,G192A与K279N突变减弱了SPOP对SIRT2的降解作用,而R121Q突变对此功能无影响。8.为探索SPOP突变抑制其降解SIRT2的作用机制,我们检测了 MATH结构域中的突变位点(G75L、R121Q、G132R)对SPOP结合SIRT2的影响以及BTB结构域中的突变位点(G192A、K279N)对SPOP结合Cul3的影响。Co-IP分析结果显示,与野生型的SPOP比较,G75L和G132R突变使SPOP丢失了与SIRT2的结合能力,G192A和K279N突变减弱了 SPOP与Cul3的结合能力,而R121Q突变不影响SPOP结合SIRT2。这一结果与它们各自降解SIRT2的能力改变相一致,说明SPOP突变后对SIRT2的泛素化作用消失或减弱,而且不同的SPOP突变体对SIRT2的降解能力与其抑制A549细胞增殖的作用呈明显的正相关,提示SPOP通过泛素化降解SIRT2起到抑制肺癌细胞增殖的效应。结论1.SPOP在非小细胞肺癌细胞株和肺癌组织中低表达,SIRT2及FADD高表达。在非小细胞肺癌中SIRT2及FADD的高表达预示患者生存率低,且其表达状况是影响预后的独立因素。2.SPOP与SIRT2和FADD相互作用,使其泛素化,通过26S蛋白酶体降解。SPOP促进FADD降解,下调NF-κB信号通路活性,提示在非小细胞肺癌中存在SPOP-FADD-NF-κB 调控轴。3.SPOP抑制A549细胞的体外增殖。在非小细胞肺癌中SPOP存在突变,这些突变消除或减弱其对A549细胞增殖的抑制作用。4.SPOP的突变抑制或减弱其与SIRT2及E3连接酶的结合能力,从而使其对SIRT2的降解作用消失或减弱,且SPOP突变体降解SIRT2的能力与其抑制A549细胞增殖的作用呈明显正相关,提示SPOP通过促进SIRT2的泛素化降解起到抑制肺癌细胞增殖的效应。