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黄酮类化合物因其具备的多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的作用而成为目前高端功能性营养化学品的代表。然而目前黄酮类化合物的获得主要依赖于低效、高成本的植物提取,这限制了黄酮类化合物的大规模商业化应用。本文以大肠杆菌异源合成黄酮类骨架物质为研究对象,系统探索了利用合成生物技术生产高附加值产品如营养保健品或者医药类物质的可行性,通过基于从头设计的途径构建、基于模块化改造策略的途径优化和基于基因沉默系统的菌体代谢网络改造等一系列的合成生物学方法和策略,实现了黄酮类骨架物质柚皮素和生松素在大肠杆菌中的高效异源合成。本文建立的创新策略和阐明的机制,将为采用合成生物技术高效合成植物天然产物提供具有普遍意义的理论与技术参考。主要研究结果如下:(1)利用从头设计原则异位重构了黄酮骨架物质生物合成途径。黄酮骨架物质无法在常见的微生物中进行合成,需要构建一条外源的从头合成代谢途径。通过引入抗反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶、分支酸变位酶、预苯酸脱水酶、预苯酸脱氢酶来构建葡萄糖至芳香族氨基酸的合成途径,引入高活性的深红酵母的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)或酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase,TAL)、香芹菜的4-香桂酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:Co A ligase,4CL)、矮牵牛的查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)和紫苜蓿的查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI),在大肠杆菌中重构芳香族氨基酸至黄酮骨架物质的合成途径。进一步引入三叶草根瘤菌中的丙二酰辅酶A途径(mat B和mat C基因)提高途径中限制性辅因子丙二酰辅酶A的含量。在此基础上,大肠杆菌可以利用葡萄糖合成生松素和柚皮素的产量分别达到2.2 mg/L和4.5 mg/L。(2)利用模块化策略优化黄酮骨架化合物的从头合成途径。黄酮从头合成途径本身具有较复杂的代谢途径,还涉及众多前体合成和修饰相关基因,为了最大程度的提高细胞生产能力,引入模块化代谢工程改造理论进行途径优化。将总个途径分为四个模块:模块I为L-苯丙氨酸或L-酪氨酸合成途径;模块II由TAL和4CL组成;模块III由CHS和CHI组成;模块IV由mat B和mat C组成。通过选用四个具有不同拷贝数的质粒来改变模块代谢通量,生松素和柚皮素产量分别达到40 mg/L和50.2 mg/L。在总途径优化中,作者发现从芳香族氨基酸到黄酮骨架物质的途径为合成目标产物的瓶颈步骤,因此再次引入模块化改造策略对此瓶颈步骤单独进行精细改造。将此瓶颈步骤重新划分为三个模块,通过四个不同拷贝数的质粒和两个不同强度的启动子来改变模块的代谢通量,以平衡产物合成途径。在优化合成途径后,生松素和柚皮素的产量分别提高至84.2 mg/L和105.1 mg/L。(3)利用反义RNA基因沉默系统来调节脂肪酸代谢途径。丙二酰辅酶A是合成众多天然产物的重要前体物质,然而在胞内这种辅因子大多被用于生产脂肪酸。传统的基因敲除方法调控脂肪酸代谢途径会导致菌体生长受缓甚至死亡。基于上述原因,探索能否通过构建反义RNA基因沉默系统来调节脂肪酸代谢途径。研究表明,目标基因的5’端非翻译区域(5’-UTR)显著影响反义RNA的抑制效率,而开放阅读框对反义RNA抑制效率并无多大影响。将此反义RNA系统导入菌体内同时调控目标基因fab B和fab F(分别编码β-酮酰基酰基载体蛋白合成酶I和II)的表达,发现当fab F的基因抑制效率控制在58.2%时,随着fab B的基因抑制效率提高,目标产物的产量提高;在fab B的基因抑制效率到达一个中间值后,继续提高fab B的基因抑制效率会导致目标产物产量下降。经反义RNA调控后,胞内所产生丙二酰辅酶A含量达到了途径所需的饱和值,生松素和柚皮素的产量分别达到250.1 mg/L和390.2 mg/L。(4)利用成簇的、规律间隔的短回文序列干扰系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)重构宿主细胞中心代谢网络。除脂肪酸代谢途径会大量消耗胞内的丙二酰辅酶A外,胞内中心代谢途径也始终占细胞资源使用的主导地位并且在丙二酰辅酶A合成时竞争性使用胞内的碳源和能源。为了进一步增加胞内丙二酰辅酶A的含量,并摆脱依赖于前体物质(丙二酸或者生物素)供给的丙二酰辅酶A生成方式,作者利用CRISPRi系统对宿主细胞的中心代谢途径进行调控,使得胞内资源最大程度的流向目标途径。首先利用该系统抑制各个候选基因,将能够提高胞内丙二酰辅酶A(>223.3%)含量的定为目标基因;然后通过改变目标基因的抑制效率,使得在提高胞内丙二酰辅酶A含量的同时不改变菌体生长速度(最终OD600的下降少于10.0%)。在此基础上,探索多基因抑制对于菌体生长的影响,生松素和柚皮素的产量提高至260.1mg/L和421.6 mg/L。(5)通过分析、减轻菌体的代谢负担来探索基因工程菌一步法发酵生产黄酮骨架化合物的可行性。目前微生物法生产黄酮类物质均采用传统的两步法。菌株首先需要在营养丰富的培养基中进行菌体生长。在生长到一定程度之后菌株被收集转移到基本培养基中进行产物的生成。这直接导致了微生物法生产黄酮骨架物质都局限在摇瓶水平上。为了扩大微生物发酵在黄酮生产上的应用,研发出菌株的一步法发酵策略至关重要。首先,在摇瓶中进行发酵培养基种类、条件和组分的优化,进而在3-L发酵罐上进行葡萄糖浓度和p H的优化。结果表明,高p H值有利于黄酮骨架物质合成途径上游途径基因的表达或者催化,而低p H值有利于下游途径基因的表达或者催化。基于此理论,提出了两阶段p H控制策略,即在发酵过程0-10 h将p H控制在7.0,发酵10 h后将p H减少到6.5,最终首次在发酵罐上生松素和柚皮素的产量达到150.3 mg/L和261.3 mg/L。