论文部分内容阅读
CRISPR/Cas9系统基因编辑技术的发现发展,为人类疾病尤其是罕见遗传病的基因治疗提供了更有利的技术平台,为精准医疗提供了新策略。如何最大限度地降低和评估脱靶效应、提高其在干细胞中的基因编辑效率,是CRISPR/Cas9系统走向临床应用的前提和关键。本论文借助细胞中DNA双链断裂(DSBs)后自发进行的非同源末端连接(NHEJ)或同源介导的双链修复(HDR)两种机制,将带有目标基因序列向导RNA(guide RNA,gRNA)的一个或多个CRISPR/Cas9系统导入人的细胞系和干细胞中,诱发DNA双链断裂,进而诱发基因序列的插入、修饰和缺失,提高靶向编辑的效率和准确性;同时利用整合酶缺陷型慢病毒载体(Integration-Defective LentiviralVectors,IDLVs)能够优先识别DNA双链断裂的特点,对CRISPR/Cas9系统产生的脱靶位点进行了评估,并优化了干细胞中的基因编辑效率。第1章CRISPR/Cas9系统中gRNA脱靶效应评估新方法的建立近年来,CRISPR/Cas9系统广泛地应用于动植物的基础研究中,更有望在未来应用于临床疾病治疗。而脱靶效应的存在始终是一个后患,已有的基于脱靶位点的网络分析工具及体外验证方法往往无法体现细胞内的真实脱靶情况,为了更安全、更精准的应用CRISPR/Cas9系统,对经过基因编辑后的细胞进行全面的脱靶位点筛查,显得非常的重要。已有文献报道,线性的双链IDLV基因组能够识别经过ZFNs系统诱导产生的双链断裂,并通过非同源末端连接的修饰方式,整合到双链断裂位点,进而用于检测ZFNs系统的脱靶效应。我们将其创新性的应用在CRISPR/Cas9脱靶位点的全基因组筛查中。针对两个突变后会导致疾病的靶基因,WAS综合征基因(Wiskott-Aldrich Sydrome,WAS)和酪氨酸氨基转移酶基因(Tyrosine Aminotransferase,TAT),我们分别设计了 3个gRNAs及一对TALEN作为比较。经过CRISPR/Cas9或TALEN转染过的HEK293T细胞,第二天转导入携带氨基糖苷类抗生素——嘌呤霉素(puromycin)筛选标记的IDLV病毒,经筛选后收集阳性克隆的全基因组DNA,利用非限制性(nonrestrictive,nr)线性扩增介导的PCR(Linear Amplification-Mediated PCR,LAM-PCR)结合深度测序(deep sequencing)的方法,定位阳性细胞全基因组中成簇的IDLV插入位点(Clustered IDLV Integration Sites,CLISs),并对各位点进行分析。我们发现,由简短的gRNA识别靶向基因的CRISPR/Cas9系统,其脱靶情况差异很大;当gRNA比识别位点的DNA序列多一到两个或者少一到两个碱基时,若能在gRNA与DNA序列结合时形成凸起(bulge),这样的脱靶位点仍然能够产生双链断裂,像这种表面上存在大于4个错配碱基的错配位点,目前的网络运算法则是无法预测到的。本研究证实并检测了 CRISPR/Cas9系统的脱靶问题。该方法非常灵敏,可以检测到切割效率不低于1%的脱靶位点,虽然无法识别全部的脱靶位点,此方法却是在全基因组水平上无偏的筛查。作为一种生物学的分析方法,该方法对CRISPR/Cas9系统的改进提供了新思路与评测平台。第2章多能干细胞中CRISPR/Cas9介导的高效率的同源重组修饰多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)如胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和诱导性多潜能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)可用于疾病模型的建立,为研究发育生物学、疾病的病理机制提供了一个可以在培养皿中操作的平台。携带疾病基因的PSCs可分化为疾病特异性的细胞或组织,进行高通量毒理/药效筛选,有望填补动物模型与临床试验的中间环节,节约药物开发成本。以往的研究中,在人PSCs中进行准确基因编辑的效率很低,本研究旨在提高人PSCs中的基因定点修饰效率。CRISPR/Cas9系统可以在目标基因诱发双链断裂,存在足够模板序列的情况下,可促使细胞通过同源重组的方式进行准确编辑。依据此原理,我们针对WAS基因第6个内含子的高突变位点区域,设计了 2个gRNAs,结合IDLV携带的带有筛选标记的模板序列,对目标区域进行准确的基因修饰。我们发现,通过IDLV携带模板序列的方法,经筛选后,同源重组的正确率效率高达50%;推测并验证了晶状体上皮源性生长因子(Lens Epithelium-Derived Growth Factor,LEDGF/p 75),作为细胞内促进同源重组修复方式的主要蛋白,可与IDLV作用元件中的整合酶(Integrase,IN)相结合,将模板序列拉到双链断裂位点,进而促进同源重组修复的发生。本研究优化了人PSCs中精确基因编辑的效率,并首次提出并验证了LEDGF/p75蛋白在IDLV携带模板序列促进同源重组过程中的作用。第3章造血干细胞中CRISPR/Cas9介导的靶向删除在β-globin疾病治疗中的应用β地中海贫血(β-thalassemia)和镰刀型贫血症(Sickle Cell Disease,SCD)两种β-globin异常疾病,是研究得比较清楚的两种单基因遗传性疾病。都是由于β-globin珠蛋白亚基突变而导致的成人血红蛋白(Adult Hemoglobin,HbA)异常,进而影响血红蛋白的功能。临床上发现,病情的严重程度与患者自身胎儿血红蛋白(Fetal Hemoglobin,HbF)的表达水平密切相关,因此可以通过增加患者体内HbF的含量来缓解β-globin疾病的症状。以往的研究发现,BCL11A基因第二个内含子中一段约10kb的DNA序列,在正常人红系发育过程中,可以特异性增强BCL11A基因的表达,从而抑制了 HbF中的组成元件——γ-globin的表达。因此,通过删除这个特异性的增强子,减少BCL11A基因的表达,进而增加HbF含量的方法,可以作为缓解β-globin疾病病情的新策略。针对BCL11A基因的特异性增强子区域,我们在其两侧分别设计了一对gRNA,通过同时诱发此区域的的两端发生双链断裂,达到删除DNA片段的目的。我们将包含两个 gRNA 的 CRISPR/Cas9 系统导入 HUDEP-2(Human Umbilical Cord Blood Derived Erythoid Progenitor-2)细胞系,构建纯合型和杂合型细胞株,进而检验BCL11A与γ-globin的表达水平及它们之间的关系;此外,我们利用同样的系统,在CD34+造血干细胞中进行了验证。我们发现,造血干细胞中的大片段基因删除效率远远低于细胞系;增强子缺失的细胞株,纯合型中γ-globin的表达水平在β类globin中的比例,从对照组的1%提高到45%,杂合子则提高到20%左右;造血干细胞中,应用电转的方式带入大的质粒载体,细胞的存活率和转染效率都较低,γ-globin的比例增加了 7%。本研究验证了 BCL11A与γ-globin基因表达的负相关性,通过对增强子的破坏可以显著提高HbF的含量。这种通过改变致病基因的调控因子,而不是直接改变遗传物质的方法,具有很大的优势,为疾病的基因治疗提供了新思路。