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鱼类栖息的水域环境易遭遇各种病原微生物的侵染,它们的机体拥有比其他生物更强的免疫系统来抵御这种复杂的生存环境。这种超强的免疫系统得益于它们的机体中有许多天然的抗菌肽(antimicrobial peptides,简称AMPs)——溶菌酶和防御素。溶菌酶(lysozyme,EC 3.2.1.17)是一类能水解肽聚糖的酶的总称,是机体重要的先天性免疫物质,参与水解细菌的细胞壁,具有抑制外源微生物生长的作用。防御素(defensin)是一类对抗外源病原体入侵的肽类物质,是动物自身免疫防御系统的重要组成部分。本研究聚焦于鱼类来源的溶菌酶和β-防御素。目前,在水产养殖和加工领域需要使用大量的抗生素和防腐剂。若能利用天然抗菌肽取代部分抗生素和防腐剂的使用,对于改善水产品的质量以及提高水产品的经济效益是非常有意义的。由于天然抗菌肽在生物体内的含量低,并且体外抑菌效果有限。因此以鱼类来源的天然抗菌肽为基础,设计杂合抗菌肽,来增强其效果;并通过DNA重组技术在体外大量生产,符合目前水产品养殖和加工产业的需求。本研究主要开展了鲤鱼(Cyprinus carpio)g型溶菌酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的重组DNA表达的研究以及斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)c型溶菌酶与斑马鱼(Danio rerio)β-防御素杂合肽在毕赤酵母中的重组DNA表达的研究。g型溶菌酶是参与鱼体先天性免疫的重要蛋白质。本研究从鲤鱼鳃中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG)。该基因的全长cDNA为558bp,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(Glu73,Pro86和Asp97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征。根据鲤鱼与其他生物之间g型溶菌酶氨基酸序列的比对结果,表明鲤鱼鳃中发现的g型溶菌酶和头肾中发现的g型溶菌酶的同源性最高。通过PCR方法在CLYG的5’和3’端分别引入XhoI和XbaI酶切位点。扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG。通过菌落PCR、双酶切鉴定和DNA测序证明重组表达载体pPICZαA-CLYG被成功构建。将已成功构建的pPICZαA-CLYG经SacI线性化后,电转至毕赤酵母X-33,Zeocin筛选得到的阳性转化子。经酵母基因组PCR鉴定,表明目的基因成功整合到X-33酵母基因组中。在1.0%(v/v)甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导表达72 h,获得重组体CLYG。SDS-PAGE和Western blot分析显示,在毕赤酵母中成功表达了重组体CLYG。斑马鱼β-防御素是有6个保守的半胱氨酸残基组成分子内二硫键的阳离子小分子抗菌肽。斑点叉尾鮰c型溶菌酶有2个催化位点(Glu50和Asp67),8个高度保守的半胱氨酸残基形成4对分子内二硫键。两者有协同作用,适合融合表达。在本研究中,通过SOE-PCR将密码子优化后的斑点叉尾鮰c型溶菌酶成熟肽基因(lyc)与斑马鱼β-防御素成熟肽基因(defbl3)进行串联,以期在毕赤酵母中表达一种新型的杂合抗菌肽(LD)。4个甘氨酸柔性连接位点和肠激酶酶切位点序列被设计用于连接defbl3和lyc。利用Xho I和XbaI酶切位点,将扩增到的串联基因片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-LD。再通过同尾酶Bgl II和BamHI反复的酶切连接,构建包含二拷贝和四拷贝表达盒的重组表达载体pPICZαA-LDn(n=2或4),并且用Bgl II和BamHI双酶切鉴定。载体用Bgl II线性化后,电转至感受态毕赤酵母X-33,筛选得到多拷贝转化子。转化子的拷贝数通过实时定量PCR确定,表明构建多拷贝表达盒的确可以增加目的基因整合到酵母基因组的拷贝数。0.75%(v/v)甲醇诱导表达120h后,用亲和层析纯化发酵上清得到重组体杂合抗菌肽LD。蛋白质电泳和Western blot验证了重组体LD在毕赤酵母中的表达。各拷贝转化子进行诱导表达,结果说明酵母转化子的目的基因拷贝数与表达量存在正相关关系。X-33/pPICZαA-LD4的表达量最高,是X-33/pPICZαA-LD的1.67倍。该结果证明了体外构建多拷贝表达盒重组表达载体来增加目的蛋白表达量的策略是有效的。通过监测酵母细胞的生长状况,发现该杂合抗菌肽LD比defbl3更适合在毕赤酵母中表达。抑菌实验表明重组体LD对革兰氏阳性菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)有抑菌活性。本研究成功地在毕赤酵母表达系统中用甲醇诱导表达重组鲤鱼g型溶菌酶和重组体杂合抗菌肽LD。为进一步了解鱼类溶菌酶和β-防御素的蛋白性质及功能奠定了基础,也为其开发应用创造了条件。