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第一部分大鼠肝部分切除术及慢病毒转染模型的建立[目 的]探讨建立SD大鼠肝部分切除及慢病毒转染模型的方法和技巧,为后续肝再生实验研究建立可靠模型基础。[方 法]使用2/3肝部分切除术,利用构建的CaMKⅡγ过表达(LV-CaMKⅡγ)、干扰(LV-CaMKⅡγRNAi)及相应空白载体的慢病毒体系,经盲肠静脉分别转染入肝切除术后大鼠体内,并建立空白对照组。五组实验大鼠观察术后并发症,存活,死亡情况,并分别于切肝后1,3,5,7d处死,取肝组织行慢病毒荧光检测;QPCR,Western Blot检测CaMKⅡγ的mRNA和蛋白表达情况;免疫组化检测CaMKⅡγ的表达和组织空间位置情况。[结 果]1.利用SD大鼠成功建立2/3部分肝切除术动物模型,术后并发症少,存活率高,大部分建模大鼠能存活到实验设计取肝时间,死亡4只大鼠。2.荧光检测示在LV-CaMKⅡγRNAi感染和其对照慢病毒组中观察到红色荧光,两组荧光表达量随时间增加渐减少;在LV-CaMKⅡγ感染和其对照慢病毒组观察到绿色荧光,两组荧光表达量随时间增加逐渐减少。3.QPCR检测和Western Blot检测结果,即同一时点LV-CaMKⅡγ组的mRNA和蛋白表达最高,LV-CaMKⅡγRNAi组的mRNA和蛋白表达最低。术后lday,病毒干预组与对应对照组无差异,术后72小时、第5day、第7day,LV-CaMKⅡγ组的表达高于其对照组(*P<0.05),LV-CaMKⅡγRNAi的表达低于其对照组(*P<0.05)。LV-CaMKⅡγ组的蛋白在第5天表达最明显。QPCR检测趋势同Western Blot检测,但LV-CaMKⅡγ组的表达在第3天表达最明显。4.免疫组化染色CaMKⅡγ阳性呈棕黄色,细胞质表达量最多,其表达趋势同Western Blot检测相一致。[结论]1.60-70%(2/3)肝切除模型,可最大程度诱发肝再生潜能,受病理因素影响小,准确量化了肝切除体积,易于操作,术后并发症,死亡率低,是研究肝增殖理想的动物模型。2.经盲肠静脉注射慢病毒转染肝细胞,有效改变大鼠肝细胞内CaMKⅡγ基因蛋白的表达,达到了实验研究目的,为进一步探讨CaMKⅡγ对肝再生的影响及其机制研究建立模型基础。此建模方法可靠性高,安全性好,可重复性强,且干扰小。第二部分CaMKⅡγ表达变化对大鼠肝切除术后肝再生的影响及机制研究[目 的]探究CaMKⅡγ对大鼠肝切除术后肝脏再生能力,肝细胞增殖周期,肝脏合成功能恢复等方面的影响及其机制。[方 法]1.使用核磁共振检测大鼠肝体积用于实验动物入组及间接测量切除术后再生肝体积,排水法和MRI法测得肝体积的相关性分析。2.各实验组不同时间点免疫组化法检测肝组织Brdu和PCNA表达情况;免疫荧光法检测Ki67表达情况。3.各实验组不同时间点ELISA法测前白蛋白水平。4.透射电镜观察肝细胞超微结构变化。[结 果]1.核磁共振测大鼠肝体积术后1day,各病毒干预组与空白对照组体积无统计学差异(P>0.05)。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的体积增长高于其对照组(*P<0.01),LV-CaMKⅡγRNAi组体积增长低于其对照组(*P<0.01)。而 3day、5day、7day,con 组,LV-CaMKⅡγ-NC 组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC 组之间体积增长无明显差异(P>0.05)。排水法(x)和MRI法测得肝体积(y),R=0.992,R2=0.983。直线回归方程为y=0.064+0.879x,二者高度相关。2.不同检测方法,PCNA和Ki67的肝增殖趋势相一致。术后1day,各病毒干预组与空白对照组已有表达但阳性染色率无统计学差异(P>0.05)。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的阳性染色率高于其对照组(*P<0.01),LV-CaMKⅡγRNAi的阳性染色率低于其对照组(*P<0.01)。而3day、5day、7day,con组,LV-CaMKⅡγ-NC 组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC 组之间无明显差异(P>0.05)。Brdu术后3天各组才开始有表达,表达趋势与PCNA和Ki67相一致。3.血清前白蛋白在术后1day,各病毒干预组与空白对照组浓度无统计学差异(P>0.05)。随天数增加浓度升高,以第3天到第5天升高明显,第5天浓度接近正常水平。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ 组浓度高于其对照组(*p<0.01),LV-CaMKⅡγRNAi 组浓度低于其对照组(*P<0.01)。而 3day、5day、7day,con组,LV-CaMKⅡγ-NC组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC组之间浓度无明显差异(P>0.05)。4.PH术后1天,电镜下con组:线粒体肿胀,可见空泡状结构。LV-CaMKⅡγ组:线粒体数目增多且明显肿胀,粗面内质网数目也增多。LV-CaMKⅡγRNAi组:线粒体及粗面内质网数量少,线粒体不肿胀。术后3天,con组:肝细胞核增大、核仁明显。LV-CaMKⅡγ组:细胞核增大、核仁明显、常染色质增多,核分裂像细胞增多。LV-CaMKⅡγRNAi组细胞核小,核仁不明显,常染色质少。术后5天,con组:可见线粒体,粗面内质网及游离核糖体等结构。LV-CaMKⅡγ组:细胞器丰富,散在游离核糖体,线粒体及粗面内质网结构增多。LV-CaMKⅡγRNAi组:细胞器少,线粒体及粗面内质网数量少,游离核糖体少,胶原纤维的增生。[结 论]肝脏是一种增殖能力极强的器官,肝大部切除术后的SD大鼠可在一周内恢复原有肝脏体积和功能。CaMKⅡγ是一种重要的肝再生调节激酶,增加体内CaMKⅡγ的表达将活化肝细胞合成代谢,促进肝细胞分裂增殖周期,使肝脏体积更快速增长,进而加速肝脏功能的恢复;而干扰CaMKⅡγ的表达将阻滞肝细胞代谢及分裂,减缓肝体积增长和功能恢复。此研究是在前期CaMKⅡγ对肝再生影响研究基础上的重要补充。不仅为肝再生的实验研究提供参考,也为肝再生的临床应用提供理论依据。预计CaMKⅡγ将作为临床应用中调控肝再生的重要靶点。