脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,因其侵袭性、高复发率等特征,治疗方法目前尽管由单一手术治疗发展到手术为主联合放射及化学治疗的综合治疗方案,但患者预后并没有得到明显改善。研究表明新型化疗药物可使恶性脑胶质瘤病人生存获益,但延长生存的作用有限。肿瘤耐药是化疗失败的主要原因,尤其是肿瘤的多药耐药性(MDR),是肿瘤耐药的常见方式,更是当前化疗中亟需解决的难题。BMP是TGF-p家族中一个很重要的亚家族,是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白。近年研究发现,BMP不仅在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用,而是涉及几乎全身所有系统,在中胚层的诱导和分化、造血组织的形成和发育、神经系统的发育和修复,多种恶性肿瘤的发生、发展及预后等方面都起着重要作用。但BMP4与肿瘤尤其是胶质瘤的化疗敏感性的关系目前研究尚较少。本课题对BMP4调控U251耐药细胞株化疗敏感性的作用及机制展开体外研究,首先建立替莫唑胺诱导的胶质瘤耐药细胞株,再研究BMP4对胶质瘤耐药特性及相关基因表达的影响,最后初步探讨BMP4调控胶质瘤耐药细胞耐药性的可能机制。第一部分人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ的建立及其生物学特性研究目的：在体外建立对替莫唑胺耐药的人脑胶质瘤细胞株,对于进一步探讨胶质瘤耐药的分子机制以及寻求逆转胶质瘤耐药的有效策略,提高胶质瘤的化疗效果有重大意义。同时观察耐药细胞的生物学特性及检测耐药相关基因在耐药细胞中的表达情况。方法：采用不同梯度浓度的替莫唑胺(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/ml)递增作用于U251细胞,使其产生耐药性。光镜观察细胞生长形态；通过细胞计数计算细胞倍增时间；MTT法检测其耐药性；流式细胞仪检测耐药细胞株细胞周期的变化；RT-PCR法检测耐药细胞株中MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1等耐药基因的表达变化情况。结果：采用间歇浓度递增法成功建立了胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ,光学显微镜下可见耐药细胞胞体增大,呈多形性,胞核呈增大的明显不规则状,胞质内的颗粒样物质增多：U251/TMZ的倍增时间为(14.64±1.98)h,亲本细胞系U251的倍增时间为(10.26±1.03)h,两者相比较有明显差异性；MTT法检测其对替莫唑胺的细胞耐药倍数为6.13倍；流式细胞仪检测细胞周期结果显示U251/TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和S期明显减少,G2/M期明显增多。RT-PCR检测U251/TMZ耐药细胞株中的MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1等耐药基因的表达,发现其表达含量均明显上调。结论：采用间歇替莫唑胺浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤细胞系U251/TMZ多药耐药系,且其耐药性稳定,耐药细胞株中MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1的表达明显上调,可能与其耐药性的形成有关。第二部分BMP4与人脑胶质瘤化疗耐药的相关性研究目的：骨形成发生蛋白4(BMP4)是一种多功能因子,其与人体生长发育及多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,但与肿瘤化疗耐药的关系目前尚不清楚,本课题探讨BMP4在人胶质瘤组织细胞中与耐药相关基因MnSOD、BCL-2表达的关系,并分析BMP4与胶质瘤细胞化疗耐药的相关性及对耐药细胞耐药性逆转的作用。方法：构建含有98例不同级别人脑星形胶质细胞瘤标本的组织芯片,评估胶质瘤标本中BMP4与MnSOD、BCL-2在不同级别胶质瘤中表达的相互关系。在诱导建立胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ过程中,检测BMP4随TMZ药物浓度的递增其表达含量的变化。将BMP4质粒体转染U251/TMZ耐药细胞中,检测耐药细胞对TMZ化疗敏感性的变化。结果：在人体胶质瘤标本中,BMP4表达强度与MnSOD表达呈负相关(r=-0.3835,P<0.05),与BCL-2表达呈负相关γ=-0.2391, P<0.05), U251/TMZ耐药细胞株成功构建后其BMP4表达明显降低,提示BMP4可能与胶质瘤的耐药性相关。将BMP4质粒体转染耐药细胞株后,细胞耐药性被成功逆转,替莫唑胺作用下耐药细胞抑制率明显上升。结论：BMP4在人脑胶质瘤组织中与耐药基因MnSOD、BCL-2的表达明显相关,BMP4在U251/TMZ耐药细胞株中的表达明显下降,BMP4的表达与胶质瘤的耐药性密切相关。将BMP4转染到U251/TMZ胶质瘤耐药细胞株中,替莫唑胺作用下可明显提高耐药细胞的生长抑制率,证实其可调控胶质瘤耐药细胞的化疗敏感性。第三部分BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ化疗敏感性的作用机制研究目的：BMP4调控胶质瘤耐药细胞的化疗敏感性机制目前尚不清楚,本课题研究BMP4逆转U251/TMZ耐药细胞化疗耐药的作用及可能机制,探讨BMP4及其介导的相关信号通路在调控U251/TMZ耐药细胞株化疗敏感性中的作用机制。方法：BMP4质粒转染U251/TMZ耐药细胞,MTT检测转染后替莫唑胺作用下细胞的活性变化,Western-blotting检测细胞中MDR1、BCL-2、TopoⅡ的表达变化。检测转染后U251/TMZ耐药细胞中Smad1/5/8、p38的磷酸化水平。替莫唑胺作用下分别阻断BMP/Smad及p38MAPK信号途径,MTT法检测耐药细胞的活性,Western-blotting检测MDR1、BCL-2、TopoⅡ的表达变化。结果：转染了BMP4质粒的耐药细胞株,在替莫唑胺作用下,细胞活性明显下降,显示BMP4可增强U251/TMZ耐药细胞株的化疗敏感性。转染BMP4后,U251/TMZ耐药细胞中BCL-2的表达下降、Topo Ⅱ的表达增加,同空白转染组比较有明显的统计学差异(P<0.05),MDR1表达降低,同空白转染组间无明显统计学差异(P>0.05)。BMP4质粒转染入U251/TMZ耐药细胞中后,Smad和p38MAPK信号通路均被激活。分别阻断耐药细胞中的BMP/Smad和p38MAPK信号通路,替莫唑胺作用下耐药细胞生长抑制率明显下降。RNAi阻断Smad通路后,BCL-2的表达明显上升,Topo Ⅱ的表达明显下降,与干扰前相比较,有显著的统计学差异(P<0.05),MDR1的表达上升,但与干扰前相比较,没有显著统计学差异(P>0.05),特异性阻断剂阻断p38MAPK信号通路后,耐药细胞中BCL-2、MDR1的表达明显升高,Topo Ⅱ的表达明显降低,与未阻断的耐药细胞相比较,有显著的统计学差异(P<0.05)。结论：BMP4可调控胶质瘤U251/TMZ耐药细胞株的化疗敏感性,其机制与调节耐药细胞中BCL-2. TopoⅡ的表达变化密切相关。BMP4可激活耐药细胞中Smad和p38MAPK信号通路,BMP4可能通过BMP/Smad和p38MAPK信号通路反馈调控U251/TMZ耐药细胞中BCL-2、TopoⅡ的表达。