论文部分内容阅读
目的在克隆日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子Sjcystatin基因,并表达重组Sjcy statin蛋白质分子(recombinant Sjcy statin protein, rSjcystatin)的基础上,初步探讨其对免疫性流产小鼠模型的流产抑制作用及其对CD4+CD25+Treg、FOXP3、Th1/Th2型细胞因子的影响,为虫源性免疫抑制因子用于治疗女性不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)及其它自身免疫性疾病积累实验室研究阶段的科学依据。方法(1)rSjcy statin的表达与纯化：将Sjcystatin基因的开放阅读框(ORF)连接到pET-3C载体上,并将其转化到大肠杆菌BL21AI中,阿拉伯糖诱导rSjcy statin表达,用镍离子螯合亲和层析柱纯化rSjcy statin,将纯化产物进行SDS-PAGE电泳和western blotting鉴定。(2)rSjcy statin的干预效果研究：120只CBA/J雌性小鼠被随机分成4组：正常妊娠组,10只；URSA组,10只；环孢素A组,10只；rSjcystatin组,90只。rSjcystatin组又分为9个亚组,每亚组CBA/J雌性小鼠10只,各亚组孕鼠分别于孕0.5d、孕4.5d、孕9.5d进行腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、20 mg/kg的rSjcystatin;CsA组孕鼠于孕4.5d腹腔注射5mg/kg的CsA。孕14.5d处死各组孕鼠,计算胚胎吸收率。(3)rSjcy statin的干预机制研究：将rSjcystatin改善胚胎吸收率效果最佳亚组(4.5d,10mg/kg)与正常妊娠组、URSA组、CsA组进行对比研究,运用流式细胞分析技术检测孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例；采用FOXP3免疫组化标记孕鼠子宫蜕膜病理切片,计算光密度IOD值；测序分析检测FOXP3转录水平差异,并用iTRAQ方法定量分析孕鼠蜕膜FOXP3蛋白水平：ELISA法测定孕鼠血清IFN-γ、IL-10的含量；RT-PCR法检测孕鼠脾脏组织TNF-α、IL-4的转录水平。结果(1)rSjcystatin各亚组的胚胎吸收率均明显低于URSA组(p<0.01)；其中,效果最佳的是孕4.5d,10mg/kg亚组,其胚胎吸收率降至(5.88+0.13)%,显著低于田cystatin其他各亚组(P<0.01)；与正常妊娠组、CsA组相比较,均无显著性差异(p>0.05)。(2)rSjcystatin组的孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例为(9.37+0.42)%,显著高于URSA组(p<0.01)；与正常妊娠组、CsA组相比较,无显著性差异(p>0.05)。(3)rSjcystatin组、正常妊娠组、CsA组的孕鼠子宫蜕膜病理切片FOXP3免疫组化标记的IOD值分别为7947.66±25.38、14754.9±36.27、11044.86±49.88,均显著高于URSA组的57.93±15.32(p<0.01)；URSA组蜕膜FOXP3 mRNA转录及蛋白的表达水平显著低于其他三组,rSjcy statin能上调蜕膜FOXP3 mRNA及蛋白的表达,接近CsA的上调水平。(4)rSjccy statin组血清IL-10/IFN-γ比值(0.94±0.15)与正常妊娠组(0.85±0.25)、CsA组(0.96±0.30)相比较,均无显著性差异(p>0.05),但显著高于URSA组(0.21±0.03)(p<0.01)。(5)rSjcyystatin组孕鼠脾脏组织IL-4/TNF-α比值(0.98±0.23)与正常妊娠组(0.99±0.18)、CsA组(0.92±0.15)相比较,均无显著性差异(p>0.05),但显著高于URSA组(0.074±0.05)(p<0.01)。结论(1)Sjcystatin基因可通过原核高效表达及纯化来获取足量的重组蛋白rSjcystatin,经鉴定其基因与蛋白质氨基酸序列,以及生化特性等均与Sjcystatin目标蛋白一致。(2)初步证实rSjcystatin用于干预不明原因复发性流产小鼠时能显著降低孕鼠的胚胎吸收率,改善妊娠结局。(3)初步阐明rSjcystatin对不明原因复发性流产小鼠发挥流产改善作用的机制,可能是通过诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖及母胎界面FOXP3的阳性表达,进而对Th1/Th2发挥免疫调节作用,使其向Th2型免疫应答偏倚,最终减少胚胎的免疫损伤,抑制流产。