猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病.PRRSV的基因表达是通过一系列亚基因组(sgmRNA)完成的,sgmRNA的转录采用一种特有的不连续性转录(discontinuous transcription)机制.位于Leader末端及基因组各个ORF前的转录调控序列(Transcription-Regulating Sequence,TRS-L and TRS-B)在mRNA合成过程中起着重要作用,但其作用机制尚不清楚.在北美型PRRSV感染性克隆pAPPRS基础上,本研究通过对相关基因组RNA序列进行插入、替换等一系列突变,初步鉴定了调控病毒转录的顺式调控元件(cis-acting element)并对其作用机制进行了探讨,现将研究内容分述如下: 1.北美型PRRSV弱毒APRRS株转录调控序列(TRS)的鉴定 不同PRRSV遗传型及亚型使用的TRS不尽相同.以北美型PRRSV弱毒APRRS株感染性克隆的拯救病毒(vAPRRS)为研究对象,利用RT-PCR技术首次确定了介导形成APRRS株各个sgmRNA的TRS及Leader-Body结合位点.结果表明,与其它PRRSV分离株相同的是sgmRNA7的形成受两个TRS-B(TRS123和TRS9)调控,采用经典TRS(canonical TRS)和非经典TRS(noncanonical TRS)来介导形成sgmRNA;与其它分离株不同的是,APRRS株的非经典TRS分布及使用有其特殊性.PRRSV TRS的异同性为下一步研究mRNA转录调控机制奠定了基础。 2.北美型PRRSV弱毒APRRS株的TRS功能解析 通过对PRRSV感染性克隆pAPRRS进行定点基因突变及其所致拯救病毒的鉴定,以此确定TRS-L和TRS-B突变对亚基因组转录及病毒感染性的影响.结果表明:(1)同时突变TRS-L最后两个CC的全长突变体pLeaderD对MARC-145细胞无感染性,且未产生sgmRNA7转录本;而只突变最后一个C的pLeaderR能拯救出突变病毒,但突变位点在突变病毒系列传代中发生回复突变,由此证明TRS-L3的一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有一定修复功能.(2)突变TRS123 3最后两个碱基的pM7Da或突变TRS9 3最后两个碱基的pM7Db均能拯救出病毒,而共同含有TRS9和TRS123 3最后两个碱基突变的pM7Dab不能拯救出病毒,对拯救的突变病毒进行鉴定发现,TRS123突变的拯救病毒在一系列传代中突变碱基回复,而FRS9突变的拯救病毒传代过程中稳定遗传;突变体pM7S3(含有TRS123的三个碱基突变)和pM7Db虽能拯救出活病毒,但突变都使相应的sgmRNA7转录量至零,且vM7S3滴度偏低.由此证明了TRS9和TRS123都可单独承担PRRSV sgmRNA7的转录调控,其3一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有修复功能;PRRSV的N蛋白主要来源于sgmRNA7.1的翻译.(3)pM7LDD转染细胞后能相应地检测到sgmRNA7转录,由此证明PRRSV TRS-L和反义链TRS-B的互补配对是形成sgmRNA的关键因素.(4)所有突变病毒的亚基因组中leader-body结合位点碱基均来源于TRS-B,为负链RNA不连续转录模型理论提供了直接证据。 3.北美型PRRSV弱毒APRRS株的转录调控系统改装及其RNA5转录调控机制研究 同型不同毒株PRRSV共同感染细胞时重组病毒产生率高达10％(Yuan,1999),因此为了防止弱毒苗与野毒之间重组而造成弱毒苗毒力返强,我们试图重新构建PRRSV调控系统.本研究通过定点突变,构建了含有TRS-L和TRS-B3最后一个碱基共同突变的全长突变体,重新构建了PRRSV调控系统,为研制安全的弱毒疫苗奠定了基础。在本研究室存有两个全长突变体,一个ORF4、ORF5间引入3个碱基获得的突变体能拯救出病毒,而另一个突变体引入23个碱基则不能拯救出病毒.本研究构建了一系列ORF4、ORF5间引入不同碱基数的突变体,在此基础上鉴定了sgmRNA5的调控元件.结果表明,sgmRNA的合成调控非常严格,其中局部RNA二级结构起着重要的启动子作用,且本研究界定了ORF4、ORF5间允许外源序列的最大容量在3nt～9nt. 4.北美型PRRSV弱毒APRRS株的RNA2转录调控机制研究 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,在pAPRRS的ORF1和ORF2间插入猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架(ORF),构建了全长嵌合cDNA克隆pCPV,随后进行了病毒拯救及对拯救病毒vCPV复制转录分析。结果表明,vCPV的sgmRNA2.1盗用了PRRSv形成sgmRNA2的6TRS,形成由PRRSV GP2和PCV2衣壳蛋白组成的融合sgmRNA2.1。结果还发现,外源基因的插入同时也导致PRRSV启用新TRS-B而产生新亚基因组,其中sgmRNA2.2、sgmRNA2.3及sgmRNA2.4采用PCV2序列来作为转录启动子；另一条sgmRNA2.5则为非经典亚基因组,其TRS在AUG下游。 本研究结果表明: 1)以PRRSV ORF1与2间区作为插入位点表达外源基因的重组病毒不稳定,出现插入片段的部分缺失;两株纯化病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标识疫苗奠定了基础。 2)插入片断上一些TRS样序列引入及插入过长片断导致PRRSV形成sgmRNA2的TRS本身和两翼序列RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因。 3)PRRSV可以利用TRS样外源序列作为TRS,这为进一步解剖PRRSv复制转录过程奠定了基础。