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白细胞介素33(Interleukin-33,IL-33)是IL-1家族新成员,是孤儿分子ST2配体,广泛表达于多种组织与细胞,主要参与调节Th2型免疫与炎症反应,与多种过敏性及自身免疫性疾病相关。研究表明采用鼠源抗IL-33抗体封阻IL-33信号通路可以减轻过敏性鼻炎与类风湿关节炎的症状,说明IL-33可作为过敏性与自身免疫性疾病新的潜在治疗靶点。抗体药物经历了鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体4个阶断。由于人抗鼠抗体及人抗人抗体等不良反应的发生,治疗性抗体逐步朝着全人源抗体方向发展。从全人源抗体文库中筛选全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv),然后通过基因重组技术连接scFv与人IgG的Fc段,构建全人源scFv-Fc融合抗体。scFv-Fc结构稳定,不仅具有与特异性抗原结合的能力,同时具有Fc介导补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)等多种细胞效应功能,并延长了血清半衰期。至今为止,无全人源抗IL-33 scFv-Fc融合蛋白的相关报道。目的:本项目旨构建在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)中能分泌表达活性全人源scFv-Fc的真核表达载体并进行高表达稳定细胞株筛选。方法:1.构建重组载体pcDNA3.1/SP-scFv-Fc。①RT-PCR扩增人IgG1 Fc段并插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1/Fc重组载体并测序鉴定插入序列是否正确。②合成的信号肽(signalpeptide,SP)序列并插入重组质粒pcDNA3.1/Fc,构建重组pcDNA3.1/SP-Fc载体,测序鉴定插入序列是否正确。③以前期筛选的抗IL-33全人源scFv为模板进行扩增,以酶切连接的方式插入重组质粒pcDNA3.1/SP-Fc中,构建重组载体pcDNA3.1/SP-scFv-Fc,测序鉴定插入序列是否正确。2.构建重组载体 PMH3 EN/SP-scFv-Fc。酶切重组载体 pcDNA3.1/SP-scFv-Fc,回收SP-scFv-Fc片段并插入真核表达载体PMH3 EN中,测序鉴定插入序列是否正确。3.转染CHO细胞建立稳定表达细胞系并筛选高表达细胞株。①培养CHO细胞,筛选G418的至死细胞浓度。②将测序正确的重组载体以脂质体转染法转入CHO细胞,以G418加压筛选稳定表达细胞系,RT-PCR、western blot检测稳定表达细胞系中目的基因的转录及表达情况。③在软琼脂上培养稳定表达细胞系,挑取单个细胞株进行表达,Dot blot筛选稳定高表达scFv-Fc细胞株。结果:1.重组质粒测序结果表明成功构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc、PMH3 EN/SP-scFv-Fc 重组载体,插入的SP-scFv-Fc目的基因大小为1560 bp左右。2.将构建的两组重组质粒转染CHO细胞,并进行稳定表达细胞系筛选后,提取转染与未转染细胞总RNA,进行RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果显示SP-scFv-Fc目的基因在CHO细胞中成功转录。3.裂解转染细胞进行Western blot结果显示:两组转染细胞分别在67 kDa附近有单一条带产生,而在PMH3 EN/SP-scFv-Fc重组质粒中scFv-Fc蛋白表达总水平明显高于pcDNA3.1/SP-scFv-Fc。4.将稳定表达细胞系进行无血清细胞培养液培养后,以IL-33为抗原,western blot检测细胞培养上清中scFv-Fc的分泌表达水平,结果显示转染PMH3 EN/SP-scFv-Fc的CHO细胞稳定分泌表达scFv-Fc可溶性融合抗体,并且具有与IL-33结合的生物学活性。而pcDNA3.1/SP-scFv-Fc载体可能由于表达量低,未检测到分泌蛋白。5.将稳定表达细胞系在软琼脂平板上进行培养,分别挑取不同细胞克隆株进行表达,Dot blot筛选高表达细胞细胞株,结果显示不同的细胞克隆株表达水平有明显差异,SP-scFv-Fc在PMH3 EN载体中的表达水平明显高于pcDNA3.1载体。结论:1.成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1/SP-scFv-Fc、PMH3 EN/SP-scFv-Fc;2.成功建立稳定表达scFv-Fc的CHO细胞系及高表达细胞株,scFv-Fc可分泌表达于细胞培养上清中,并具有结合抗原IL-33的生物学活性。3.scFv-Fc在PMH3 EN/SP-scFv-Fc重组载体中的表达水平明显高于pcDNA3.1/SP-scFv-Fc。