论文部分内容阅读
延髓头端腹内侧部(Rostral ventromedial medulla,RVM)是痛觉下行调制系统的核心结构,也是阿片类药物发挥镇痛效应的的关键部位之一。根据对伤害性刺激电生理反应的不同,将RVM神经元分为“启动”神经元(ON细胞)、“停止”神经元(OFF细胞),以及中性神经元(Neutral细胞)三类。ON细胞和OFF细胞是RVM内参与疼痛调节的主要神经元。伤害性刺激可以引起ON细胞放电频率增加,对疼痛有易化作用,OFF细胞则与之相反。RVM由中缝大核(Nucleus raphe magnus,NRM)、网状巨细胞核(Nucleus gigantocellularis reticularis,Gi)、外侧网状巨细胞旁核(Nucleus lateral paragigantocellular,LPGi)和网状巨细胞核α部(Nucleus gigantocellularis reticularis,alpha,GiA)等四个核团组成,这些核团含有大量向脊髓投射的5-HT能神经元,但目前对RVM的5-HT神经元在痛觉调控中所起的作用仍存很大争议。雌激素是体内重要的性激素之一,通过ERα,ERβ及G蛋白耦联型雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor-1,GPER-1)等发挥生理学效应。大量文献资料提示雌激素参与机体对痛觉的调控,但是其作用部位及受体机制仍不清楚。本课题组在前期研究中以直肠充胀(CRD)引起的腹肌放电活动(Viscero-motor response,VMR)为评价内脏痛的指标,发现向大鼠RVM微量注射雌激素后,CRD引起的VRM进行性增强,且吗啡在该部位的镇痛效应明显减弱;采用细胞外记录和微电泳的方法,我们发现雌激素选择性兴奋ON细胞,并减弱吗啡对ON细胞的抑制作用;通过免疫荧光及western blot的方法,我们发现RVM部位高表达GPER-1。这些结果提示雌激素可能通过GPER-1激活RVM的ON细胞,加强下行易化功能,发挥对内脏痛的增强效应。我们推测,在RVM部位GPER-1可能选择性表达在ON细胞,雌激素与GPER-1结合可直接(通过突触后机制)提高ON细胞的兴奋性。本研究从三个方面为上述假说提供依据:一是通过免疫荧光双标记的方法,研究GPER-1阳性细胞与5-HT神经元的关系;二是通过在体细胞内记录的方法,鉴定和标记ON、OFF和Neutral细胞,再通过免疫荧光双标记的方法研究GPER-1在不同类型神经元上表达的情况;三是通过在体细胞内记录和微电泳的方法,研究雌激素对ON细胞膜电位的影响。1.RVM部位5-HT神经元与GPER-1阳性细胞分布的特征对成年SD大鼠脑干连续切片后行TPH免疫荧光染色,对每张切片上的TPH阳性神经元距离腹侧面和中线的距离进行测量,构建RVM部位5-HT能神经元空间分布图;通过免疫荧光双标记的方法检测GPER-1与5-HT共表达情况,以明确GPER-1阳性细胞与5-HT神经元的关系。我们发现,在延髓腹侧部TPH阳性神经元形态较均一,呈梭形,长径约10~20μm,短径约5μm,分布在前囟后9.0~13.5mm范围之内。在RVM头端(前囟后9.0~11.0mm),5-HT能神经元数量少且分布范围局限于中缝大核;在RVM中心区域(前囟后11.1~11.8mm),5-HT能神经元数量增多,分布范围逐渐扩展至网状巨细胞核α部(GiA)以及外侧网状巨细胞旁核(LPGi),但网状巨细胞核(Gi)分布却很少;至RVM尾端(前囟后11.9~13.5mm),5-HT能神经元数量变少,并严格局限于中线两侧的狭小范围内。GPER-1与5-HT双标记实验发现,在RVM部位GPER-1阳性细胞与5-HT能神经元形态各异,两者交叉分布、互为近邻。在RVM局部可见许多5-HT标记的纤维,在这些纤维,5-HT免疫活性呈串珠状,与GPER-1阳性神经元胞体十分靠近,提示这些5-HT能神经元的末梢可能以非典型化学突触的形式影响GPER-1阳性神经元的功能。2.GPER-1在RVM部位痛觉调制神经元上的分布在戊巴比妥麻醉的大鼠,在前囟后11.0~12.0mm范围内在体细胞内记录RVM神经元活动,通过伤害性刺激后肢(pinch)和充胀结直肠(CRD)的方法,鉴定ON细胞、OFF细胞和Neutral细胞,通过记录电极向细胞内电泳神经生物素(Neurobiotin),然后对该范围延髓的连续切片进行神经生物素、GPER-1、TPH及MOR的免疫荧光染色,观察GPER-1、TPH及MOR表达及共表达情况。我们发现,GPER-1特异性的表达在ON细胞;ON细胞上存在MOR与GPER-1共表达,所有ON细胞均不表达TPH。OFF细胞不表达GPER-1,少数OFF细胞表达TPH。3.雌激素对RVM部位痛觉调制神经元膜电位的影响在戊巴比妥麻醉的大鼠,我们采用piggyback组合电极(将多管微电泳电极与在体细胞内记录电极粘合在一起)细胞内记录RVM内的ON细胞,观察微电泳17β-雌二醇对ON细胞膜电位的影响。发现微电泳17β-雌二醇可引起ON细胞动作电位发放频率增快,这一作用与膜电位发生去极化以及EPSP幅度增大有关。这一结果有力地证明雌激素通过突触后机制直接兴奋ON细胞,加强下行易化功能,从而发挥对痛觉的增强效应。综上所述,本课题初步探讨了RVM部位GPER-1阳性细胞与5-HT能神经元的关系,发现GPER-1与5-HT表达在不同神经元,RVM局部存在大量5-HT能神经末梢,可能以非典型化学突触的形式影响GPER-1阳性神经元及局部环路的功能;用在体细胞内记录和免疫荧光双标记的方法证明GPER-1特异性的表达在ON细胞,并进一步证明雌激素能够使ON细胞膜电位发生去极化和EPSP幅度增大,神经元放电活动增强。这些结果有力地提示雌激素在RVM部位能够通过激活GPER-1而加强下行易化通路的活动,这一信号机制可能在中枢性痛敏的发生或维持中发挥作用。