论文部分内容阅读
目的:糖尿病足(diabetic foot,DF)是糖尿病最严重的并发症之一,也是非外伤性截肢的主要原因。DF的发病机制复杂,但大量研究证实在长期高糖状态下导致微血管、大血管病变:糖尿病神经病变和外周血管病变(主要为新生血管减少),并进一步引起的足部溃疡是DF发生和发展的主要原因。因此研究如何有效的促进足部溃疡处血管的新生过程在治疗糖尿病足中具有重要的临床意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度自我更新能力和多向分化潜能,在细胞替代治疗及组织工程修复方面具有极大的临床应用价值。同时,研究证实自体MSCs移植是DF治疗最具有潜力的新方法。移植的MSCs通过自身分化和释放血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等机制促进病变部位血管新生、改善局部血流,从而缓解和改善DF。然而在长期高血糖状态下,糖尿病患者的内源性MSC的数量和质量呈现下降趋势,同时功能也受到影响。非编码微小RNAs(microRNAs,mi RNAs)是一类有转录后调节活性、高保守、大小为19-25 bp的内源性非编码单链小分子RNA,通过与靶基因3’‐非翻译区(3’‐UTR)的碱基互补配对结合,降解或抑制靶mRNA翻译,一个miRNA能调控多个基因表达,同一靶标基因又可受多个miRNAs调控。研究发现miRNAs参与了糖尿病及其慢性并发症的发生、发展,同时,miRNAs在MSCs功能的调控中也扮演着重要的角色。因此,深入研究如何改善MSCs的功能,以及miRNAs如何调控MSCs的功能对于治疗DF至关重要。方法:1、筛选与糖尿病足致病相关的候选mi RNAs1.1通过比较糖尿病足患者与健康人足部组织,筛选与糖尿病病足相关且表达差异显著的蛋白。健康自愿者抽取骨髓,体外分离MSCs,通过检测细胞表面抗原和细胞分化潜能对分离出的MSCs进行鉴定,对鉴定出的MSCs进行培养。运用PCR、WB对这群细胞进行鉴定,明确了间充质干细胞中存在着对VEGF的转录后调控的miRNAs。利用生物信息学技术(Targetcan)进行反向测序,对所有预测结果进行整合,筛选出可能调节VEGF的miRNA--miR-205-5p。(本研究已通过南昌大学第一附属医学研究伦理委员会批准)2、探讨miR-205-5p在DF中的作用机制2.1在MSCs中转染miR-205-5p的反义核酸(as-miR-205-5p),观察其对VEGF表达的影响。2.2免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)糖尿病足模型的建立:采用免疫缺陷小鼠的原因是避免异种移植排斥(小鼠对人源MSCs)对实验的影响。10周龄雄性免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,采用链脲菌素(streptozotocin,STZ)(130 mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病模型。1周后监测血糖,尾部取血测血糖值,血糖>ll.1mmo/L--16.7 mmo/L(200mg/dl-300 mg/dl)为糖尿病造模成功,1周后采用环形夹板法诱导足部皮肤溃疡损伤小鼠模型,破溃面积2平方毫米,在溃疡皮肤注射10~6个MSCs细胞(分为对照组:质粒载体组;干扰组:as-miR-205-5p干扰组),4周后观察皮肤溃疡愈合情况以及溃疡部分血管密度改变等。2.3体内实验观察MSCs中下调mi R-205-5p对DF的影响在病变部位给予糖尿病足小鼠模型皮下注射移植as-miR-205-5p修饰的间充质干细胞或对照组间充质干细胞。四周后观察溃疡伤口愈合情况,Letin染色计算溃疡部位血管密度的改变等。结果:1、VEGF在糖尿病足病变组织中表达降低,且为miR-205-5p的靶点1.1与健康人足部组织比较发现,通过ELISA实验、WB检测提示糖尿病足病变组织中VEGF表达显著降低(P<0.05)。1.2体外分离间充质干细胞,通过流式细胞技术检测CD29,CD34,CD44,CD45,CD166,HLA-DR的表达情况,确证为MSCs;通过体外诱导分化实验:阿尔新蓝染色、Von Kossa染色、油红O色鉴定间充质干细胞的分化功能。1.3结合生物信息学技术(TargetScan),在线进行反向测序分析数据确定以VEGF为靶基因的可能miRNAs。我们发现miR-205-5p表达于间充质干细胞,并且能够结合VEGF的3’-UTR区,提示VEGF可能是miR-205-5p的靶点之一。进一步通过PCR、WB、荧光素酶报告基因证实miR-205-5p可以抑制VEGF蛋白的表达。2、miR-205-5p可能通过调控MSCs中VEGF的表达改善DF2.1体外实验结果显示,转染as-miR-205-5p(miR-205-5p抑制剂)不影响间充质干细胞的功能特性,但上调MSCs中VEGF的蛋白表达。2.2 NOD/SCID小鼠腹腔注射STZ和足部环形夹板法可以成功建立DF小鼠模型。与注射移植转染质粒载体后的MSCs的对照组相比,移植转染as-miR-205-5p后MSCs的NOD/SCID小鼠在血糖水平、胰腺β细胞功能无明显改善作用,但促进皮肤溃疡伤口的愈合,并且血管密度显著增加。结论:下调MSCs中miR-205-5p的表达可以增加MSCs移植对DF的治疗效果,这可能与下调miR-205-5p上调VEGF介导的血管新生有关。本研究揭示了as-mi R-205-5p修饰的MSCs在治疗DF中的作用,完善了MSCs治疗DF的分子机制和调控手段,为临床DF的治疗提供新的靶点和的方向。