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研究背景及研究目的:原发性肾病综合征(Primary Nephrotic syndrome, PNS)是最常见的儿童肾脏疾病之一,其临床症状是肾病范围的蛋白尿、低白蛋白血症、水肿和高胆固醇血症。PNS的发病机制现仍未知,而且它是一种多元素性疾病。PNS按肾脏病理分为微小病变肾病综合征(minimal change nephrotic syndrome,MCNS),局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS),系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN),和膜性增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis,MNGN)等。PNS主要病理类型是MCNS(77.1%)和FSGS(7.9%)。患儿大都对激素敏感,但少数患儿对激素依赖或抵抗,最后发展为终末期肾病。因此阐明PNS的发病机制,针对其发病过程进行药物干预,可以为肾病患儿开辟新的诊疗途径。白介素17(Interleukin-17,IL-17),是一种促炎的细胞因子,由活化的CD4+T细胞亚群(常称为Th17)产生。IL-17家族由6种家庭成员构成,它们分别是IL-17(又称IL-17A), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17 E(又称IL-25),和IL-17F。IL-17受体家族由5种成员组成,它们分别是IL-17RA、IL-17RB、 IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。近年来国内外对IL-17在肾脏疾病方面的研究集中在狼疮性肾炎、糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾损伤和肾移植排斥损伤。有关IL-17在肾病综合征的研究报道很少。我们知道T细胞参与PNS的发病机制,而Th17分泌的细胞因子是否参与PNS的免疫机制还不明确。有研究者提出,IL-17很可能是T细胞活化和炎症之间的一座桥梁。Wang等发现Th17/IL-17通过下调podocalyxin表达水平,和诱导足细胞凋亡,从而促进PNS的发病。Liu等报道MCNS潜在的发病机制是Th17/Treg不平衡。新近少数研究资料表明IL-17在MCNS发病机制中起到主要的作用。新近资料显示,利妥昔单抗可以通过抑制IL-17,影响B细胞的消耗,或者改变足细胞的细胞骨架,干预MCNS的发病机制。IL-17A产生的主要途径是肾脏Th17细胞上的趋化因子受体CCR6与CCL20反应。IL-17信号是通过其与受体相结合来发挥作用。在炎症反应时,IL-17A可以募集中性粒细胞和巨噬细胞,从而产生多肽类蛋白,细胞因子和趋化因子(CXCL1, CXCL2,和CXCL5)。CXCL1、CXCL2能够促进中性粒细胞的趋化。IL-8也可以促进感染部位中性粒细胞的聚集,最后清除炎症病灶。CXC趋化因子配体9(chemokine ligand9,CXCL9)和CXCL10能调节Thl。在胞内病原体、肿瘤抗原以及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和IL-12的诱导下,Th0向Thl分化;Thl分泌IFN-γ、IL-2等;Th2分泌IL-4。因此,我们可以认为IL-17相关的趋化因子是CCR6、CCL20,中性粒细胞相关的趋化因子是CXCL1、CXCL2、IL-8, Th1相关的趋化因子和细胞因子是CXCL9、CXCL10、IL-12、IFN-γ。目前,国内外关于IL-17及相关趋化因子在PNS中的研究尚无报道。PNS的主要损伤是肾脏丢失蛋白质,PNS范围的蛋白尿是由于肾小球滤过膜通透性的损害,和肾小管重吸收障碍所致。肾小球滤过屏障是由三层组成:内皮细胞层,肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM),和足细胞足突层。。肾小球疾病的特点大都是裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)分子结构的改变,和足突结构重组(融合和消失)。足突消失和蛋白尿的最主要原因是GBM或足细胞一GBM之间相互作用的异常,SD区域损害,以及肌动蛋白细胞骨架和相关蛋白的改变。足细胞结构的改变引发足细胞损伤,从而导致足突的丢失。足细胞缺乏是肾小球硬化的开始。丝裂原活化激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是细胞功能活动的应激通路,对于细胞的生长、发育、分裂、凋亡等起到重要作用。哺乳细胞的MAPK通路有四种:细胞内信号调节酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk)-1和-2,c-Jun N末端酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK), p38MAPK和细胞内单个调节酶-5(extracellular signal-regulated kinase,-5,Erk5/BMK1)。研究已证实,MAPK通路在急慢性炎症中起到重要的作用。P38MAPK在抗肾小球基底膜肾炎中的表达增加,并且影响炎症细胞的聚集和肾小管的损伤。本研究通过阿霉素(Adriamycin, ADR)诱导建立的小鼠肾病综合征模型(微小病变型),观察IL-17在肾脏组织和外周血水平的变化,以及IL-17相关趋化因子CCR6、CCL20,中性粒细胞相关趋化因子CXCL1、CXCL2、IL-8,Thl相关趋化因子CXCL9、CXCL10、IL-12、IFN-γ,三组因子在肾组织中的表达变化。同时对模型小鼠应用中和IL-17抗体进行干预,观察其炎症水平和肾脏功能情况的变化。从而探讨IL-17在PNS中的促炎机制。此外,本研究亦通过体外培养小鼠肾足细胞,研究IL-17在肾足细胞炎症中的分子作用机制,以及与MAPK信号路径的相关性。进一步探讨IL-17及其相关趋化因子在儿童PNS发病及发展中的作用,为临床上进一步防治儿童PNS提供新的理论依据。研究方法:1.动物实验:随机将Balb/c小鼠分为三组,正常对照组,模型组(阿霉素肾病),IL-17中和抗体组,每组共10只小鼠。给予小鼠尾静脉注射阿霉素诱导阿霉素肾病模型(微小病变型),1周后其中1组模型小鼠给予腹腔注射IL-17中和抗体,2周后将全部小鼠处死,留取尿液、血液和肾组织。24小时尿蛋白定量采取邻苯三酚红比色法测试,ELISA检测血清IL-17、Cys C、 Kim-1、NGAL的浓度。应用HE染色、免疫组化DAB染色制作肾组织病理切片,观察肾脏组织中IL-17的表达。IL-17相关趋化因子CCR6、CCL20的mRNA表达,中性粒细胞相关趋化因子CXCL1、CXCL2、IL-8 的 mRNA表达,Thl相关趋化因子CXCL9、CXCL10、IL-12、IFN-γ的mRNA表达,均使用荧光定量PCR进行检测。2.肾足细胞培养:小鼠肾足细胞加入含10%胚胎小牛血清的1640倍的培养液,和10U/ml γ干扰素后,然后放入33℃孵育箱,细胞传代培养;然后转入无干扰素、37℃培养孵箱,使细胞分化2周后。足细胞种植于平皿,在无血清的清洁培养液中培养24小时,应用重组的小鼠IL-17蛋白100ng/ml,刺激小鼠肾足细胞共同孵养24小时。随后应用Erk、p38抑制剂10umol/l分别与IL-17刺激的足细胞孵育24小时后;收集细胞,Western Blot检测:小鼠肾足细胞中p38、Erk及p-p38、p-Erk的蛋白水平。在加用p38和Erk抑制剂后,中性粒细胞相关趋化因子IL-8、Th1相关趋化因子IL-12的mRNA表达,采取荧光定量PCR测定。结果:1.光镜的观察结果同对照组比较,模型组有球囊部分粘连,系膜细胞增生,基质增多,肾小管腔部分出现蛋白管型,肾间质炎症细胞浸润;中和IL-17抗体组比模型组轻。2.电镜的观察结果模型组与对照组比较,肾小球形态结构轻微异常,足突普遍融合。IL-17中和抗体组病变较轻。3.各组小鼠肾组织IL-17蛋白表达DAB染色显示,IL-17的阳性细胞多为胞质染色阳性,正常肾组织中有少量IL-17的表达,主要集中在肾小管,而肾小球中无表达;模型组中,肾小管上IL-17表达显著,它在肾小球中有少量表达;IL-17中和抗体组较模型组轻。同对照组比较,阿霉素肾病组、IL-17中和抗体组细胞的阳性着色度明显增强,P<0.05。模型组比IL-17中和抗体组细胞阳性着色度明显增高,P<0.05。4.各组小鼠肾组织IL-17相关趋化因子CCR6、CCL20的mRNA表达与正常对照组对比,模型组、IL-17中和抗体组CCR6、CCL20的mRNA表达均升高,P<0.05。模型组的CCR6、CCL20mRNA表达比IL-17中和抗体组增强,P<0.05。5.各组小鼠肾组织中性粒细胞相关趋化因子CXCL1、CXCL2、IL-8的mRNA表达与正常对照组比较,模型组、IL-17中和抗体组CXCL1、CXCL2、IL-8的mRNA表达均升高,P<0.05。模型组比IL-17中和抗体组CXCL1、CXCL2、 IL-8的mRNA表达升高,P<0.05。6.各组小鼠肾组织Thl相关趋化因子CXCL9、CXCL10、IL-12、IFN-γ的mRNA表达与正常对照组比较,模型组、IL-17中和抗体组CXCL9、CXCL10、IL-12、 IFN-γ的表达下降,P<0.05。模型组比IL-17中和抗体组CXCL9、CXCL10、 IL-12、IFN-γ的表达降低,P<0.05。7.各组小鼠血清IL-17水平的变化与正常对照组比较,模型组、IL-17中和抗体组的IL-17水平升高,P<0.05。模型组比IL-17中和抗体组的IL-17水平升高,P<0.05。8.各组小鼠肾功能指标血清KIM-1、NGAL、Csy C水平的变化与正常对照组比较,模型组、IL-17中和抗体组的KIM-1、NGAL、Csy C血清水平均升高,P<0.05。模型组比IL-17中和抗体组的KIM-1、NGAL、 Csy C水平升高,P<0.05。9.小鼠肾足细胞中p38、Erk及p-p38、p-Erk的蛋白水平与正常组比较,IL-17刺激组Ep-Erk、p38、p-p38的蛋白表达水平升高,其中p-p38的蛋白水平升高最明显。10.应用p38抑制剂和Erk抑制剂后,中性粒细胞相关趋化因子IL-8 mRNA表达与正常组对比,IL-17刺激组、p38抑制剂组、Erk抑制剂组的IL-8 mRNA表达均明显升高,P<0.05。与IL-17刺激组比较,p38抑制剂组、Erk抑制剂组IL-8mRNA表达均下降,P<0.05。p38抑制剂组比Erk抑制剂组的IL-8 mRNA表达明显升高,P<0.05。11.应用p38抑制剂和Erk抑制剂后,Thl相关趋化因子IL-12 mRNA表达与正常组对比,IL-17刺激组IL-12 mRNA表达明显下降,p38抑制剂组、Erk抑制剂组均明显升高,P<0.05。与IL-17刺激组比较,p38抑制剂组、Erk抑制剂组IL-12 mRNA表达均明显升高,P<0.05。p38抑制剂组比Erk抑制剂组IL-12 mRNA明显升高,P<0.05。结论:1.在阿霉素诱导的小鼠肾病模型中,肾组织IL-17表达异常增加,可以使中性粒细胞募集,参与ADR小鼠的炎症病理过程,少量的IL-17对正常肾脏功能的维持有一定作用。2.在阿霉素诱导的小鼠肾病模型中,血清IL-17的水平明显增高,提示IL-17促进ADR小鼠的炎症过程,而且它还能促使Thl细胞分化降低,大量的IL-17可以导致ADR小鼠严重的肾功能损害。3.小鼠腹腔注射中和IL-17抗体能够降低ADR小鼠血清IL-17的水平,减轻中性粒细胞募集,中和IL-17抗体抑制Thl细胞分化降低,肾功能获得改善。4.IL-17可能通过MAPK信号通路对小鼠肾足细胞炎症因子进行调控。5.IL-17能够激活p38及Erk路径信号,此过程中p38路径信号是主要的。6.IL-17促进中性粒细胞聚集,产生炎症反应,并且改变了天然CD4+T细胞向Th1/Th2分化的平衡,诱导其向Th2分化,抑制其向Thl分化。