经尾静脉移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

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目的:探讨经尾静脉移植骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)对治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的有效性及安全性,并探讨其可能的机制。方法:1.取SD大鼠长骨骨髓作为供体来源,经密度梯度离心法和组织贴壁筛选法进行体外培养并纯化BMSCs,经细胞形态、表面标记物等特性鉴定证实获得的细胞为BMSC。移植前以10mg/L的BrdU进行标记;2.线栓法制作SD雄性大鼠MCAO模型,TTC染色鉴定MCAO模型;3.根据Zea Longa神经功能缺损评分将符合标准的62只脑缺血MCAO大鼠随机分为3组:①A组:在模型建立后7d,通过尾静脉将3×10*6个BMSCs移植入大鼠体内②B组:在模型建立后7d,通过尾静脉将1×10*6个BMSCs移植入大鼠体内③C组不作处理。4.①改良神经损伤严重程度评分(modified neurological severity scores, mNSS):于大鼠移植前、移植后第3、7、14、21、28d进行mNSS评分评估神经功能恢复情况。②Morris水迷宫训练及测试:于移植后第14、28d测试大鼠学习和记忆能力。5.移植后第7、14、30天处死大鼠,取大鼠脑组织行免疫组织化学染色观察CDllb、MPO阳性细胞;BrdU单染标记移植的BMSCs;单染标记的脑源性神经营养因子(BDNF); Brdu和MAP-2双染标记BMSCs分化的神经元样细胞;Brdu和GFAP双染标记BMSCs分化的神经胶质样细胞;BrdU和vWF双染标记增殖的血管内皮细胞;Brdu和VEGF双染标记BMSCs分泌的促血管增生因子。结果:1.经密度梯度离心法和组织贴壁筛选法进行体外培养并纯化BMSCs,培养第3代的MSCs经流式细胞仪检测,表达CD90、CD71阳性率为99.74%、98.93%,表达CD45、CD34、CD14阳性率为0.36%、0.32%、0.45%,说明这一细胞群大部分处于未分化干细胞状态,并具有对塑料底物的贴附特性,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs;2.用改良线栓法制作MCAO模型后,大鼠神经功能缺损明显;结合TTC染色检测缺血侧的脑实质呈苍白色,证实造模成功。3.MCAO模型后经尾静脉移植BMSCs, A组和C组比较,行为学恢复更为明显,(P<0.01); A组和B组比较, A组行为学恢复更为明显(P<0.01); B、C两组相比mNSS评分无显著性差异(P>0.05);A组大鼠逃避潜伏期(24.53±19.093s)较C组(35.64±33.901s)缩短(P<0.05),A组跨越平台次数(4.60±1.506),较C组大鼠(2.44±0.882)明显增多(P<0.05)。4.A、B组大鼠在损伤侧大脑半球的损伤中心区、脉络丛、脑室管膜周围及血管周围处,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、 Brdu+VEGF免疫组织化学双染阳性细胞。结论:1.BMSCs可以在体外分离、传代、扩增;2.采用改良线栓法制作MACO模型简单易行,结果可靠,可以用于局灶型脑缺血再灌注损伤的研究;3.BMSCs移植入MCAO大鼠体内后,可在大鼠体内存活、分化,可以促进大鼠脑梗死后神经功能恢复,这可能与移植细胞促进梗死周边血管新生以及分泌神经营养因子等因素有关;4.BMSCs的疗效与数量有关,3×10*6有较好的疗效;5.移植治疗BMSCs是安全的,整个实验过程中未发现明显免疫排斥反应及肿瘤形成。
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