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花发育是高等植物在其生命过程中最重要的阶段,它包括3个顺序发生的过程:开花决定、花的发端和花器官的发育。其过程既受外界环境的影响,又受内在基因的调控。
同源异型盒基因(homeobox genes)是涉及生物个体发育调节的一类基因,由其编码的转录因子在花发育调节过程中有着重要作用。在前期,本实验室在研究金钗石斛(Dendrobium nobile Lind1)花发育过程中克隆了一个新基因DNKNOX1。对此基因的蛋白序列进行分析,发现其属于Homeobox基因家族,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长864bp,编码287个氨基酸,推测蛋白质等电点为4.92,相对分子量为32.1 kD。
本研究主要利用PCR技术扩增得到DNKNOX1基因的ORF片段,与表达载体pET30a(+)连接后转化大肠杆菌,构建重组表达菌(pET30a(+)-DNKNOX1 ORF)。经IPTG诱导表达出目的蛋白DNKNOX1,然后利用全基因组PCR技术分离与此目的蛋白特异结合的DNA片段。获得的主要研究结果如下:
1、通过特异性引物扩增得到DNKNOX1基因的ORF片段,连接到克隆载体pMD19 Simple T Vector上,转化大肠杆菌E.coli DH5a,成功构建重组克隆菌(pMD19 Simple T Vector-DNKNOX1 ORF);2、利用HindⅢ与EcoRⅠ酶切出DNKNOX1基因的ORF片段,亚克隆到表达载体pET30a(+)上,成功构建重组表达菌(pET30a(+)-ONKNOX1 ORF),此菌株可用来表达DNKNOX1目的蛋白;
3、在大肠杆菌中利用诱导剂IPTG(1mol/L)诱导出相对分子量约为45kD的目的蛋白,利用Ni+-NTA亲和层析柱成功纯化得到目的蛋白,为后续研究此蛋白的功能提供很好的材料;
4、金钗石斛基因组DNA经EcoRⅠ与TaqⅠ酶切后的片段与目的蛋白在一定条件下体外孵育结合,再利用磁珠分离得到与目的蛋白特异结合的DNA片段。这些片段经克隆测序,最终获得10条不同大小的候选DNA序列。经结合验证实验证明,有两条较长的DNA片段(599bp和588bp)能与目的蛋白特异结合,并经序列分析发现两条DNA片段中均存在可能的植物同源异型盒蛋白保守区域的DNA结合核心序列TGAC,推测该核心序列可能参与了DNA与目的蛋白的特异结合反应。