论文部分内容阅读
研究背景：青光眼中视网膜神经节细胞(RGCs)的变性是不可逆的,严重者可能造成永久性失明。目前视网膜神经细胞及其纤维的进行性退变是目前公认的青光眼的病理基础。大量研究表明,细胞凋亡是神经节细胞死亡的主要途径。视网膜神经节细胞在视觉信息的接收、加工以及传导中有重要的作用,了解RGC变性的潜在机制,寻求可行的治疗方案,以保护RGC损伤是学者一直以来致力研究的方向。视网膜神经节细胞的凋亡是视神经损害类疾病最后的通路,视网膜神经节细胞的改变与某些神经组织退行性病变紧密相关,视网膜神经节细胞的损伤可导致视力的不可逆损伤。许多眼病患者视力丧失都是这个原因,目前世界上还没有有效的治疗办法。炎症和神经毒素、外伤、高眼压等均可造成视网膜神经节细胞不可逆的损伤,使其发生凋亡。目前视网膜神经节细胞凋亡机制未完全清楚,可能与生化调节、基因调控等有关。在最近十年中,已经表明许多分子途径参与了RGC变性的进程,并施加了一定的保护作用,如胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子。在许多所识别的分子途径中,神经营养蛋白调节的信号传导途径,包括脑源性神经营养因子(BDNF)和它的酪氨酸激酶受体B(TrkB),被证明对不同类型的感觉神经元包括视网膜神经节细胞的存活、分化和再生至关重要。三环类抗抑郁药,包括阿米替林和丙咪嗪(IMIP),已经显示出在许多神经元系统刺激BDNF／TrkB的途径,目前比较确定的是：BDNF通过TrkB信号传导系统在抗抑郁药作用机制中起到重要作用。研究表明,不同抗抑郁药治疗一段时间后都可引起脑源性神经营养因子蛋白增加。另外,所有抗抑郁药均被发现可以增加TrkB受体磷酸化,因此我们认为,抗抑郁药作用机制可能是诱导TrkB受体活性。但抗抑郁药是否对视网膜神经节细胞产生BDNF／TrkB样的神经保护目前尚无定论。丙咪嗪是三环类抗抑郁药,有实验证实,它可以显著减少神经细胞凋亡,在海马中显示丙咪嗪(加氯胺酮)增加脑源性神经营养因子的产生和蛋白激酶C磷酸化来修改运动活性。在皮层神经干细胞,丙咪嗪同样通过激活脑源性神经营养因子信号通路保护神经元免于炎症诱导的细胞凋亡。此外,在嗅球,使用丙咪嗪长期治疗可诱导过度脑源性神经营养因子的产生,增加对伤后大脑的可塑性。因此,本研究观察三环类抗抑郁药丙咪嗪是否可通过激活TrkB途径减少视网膜神经节细胞的凋亡,旨在为视网膜神经节细胞损伤可能的保护治疗方案提供理论依据。本研究分以下三个部分进行。第一部分丙咪嗪对视网膜神经节细胞TrkB信号通路的作用目的：观察Imip对RGC-5细胞中TrkB信号通路的影响。方法：体外培养RGC-5细胞株,分为对照组、0.5|amol/L Imip组和5μmol/L Imip组,分别给予不同方法处理。对照组：不进行处理；0.5μmol/L Imip组：加入0.5μmol/L 的 Imip实验溶液培养12h; 5μmol/L Imip组：加入5μmol/L 的 Imip实验溶液培养12h。以Western印迹法进行分析,观察TrkB和ERK1-2磷酸化程度。结果：对照组与0.5μmol/L Imip组相比,二者pTrkB/TrkB和pERKl-2/ERK1-2均相似,差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组和0.5μmol/L Imip组相比,5μmol/L Imip组的pTrkB/TrkB和pERKl-2/ ERK1-2均显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：高浓度的Imip(5μmol/L)能通过磷酸化RGC-5细胞的TrkB和ERK1-2激活TrkB信号通路。第二部分丙咪嗪对氧化应激诱导的视网膜神经节细胞凋亡的保护作用目的：观察Imip对氧化应激诱导的RGC凋亡的保护作用。方法：体外培养RGC-5细胞株,分为对照组、H2O2损伤组和Imip干预组,分别给予不同方法处理。对照组：不进行处理；H2O2损伤组：加入H2O2培养48h使RGC-5细胞发生氧化应激反应诱导细胞凋亡；Imip干预组：加入H2O2之前加入μmol/L的Imip实验溶液预处理30min,后续操作同H2O2损伤组处理方法进行处理。采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,H2O2损伤组和Imip干预组的细胞凋亡率均显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05); Imip干预组的细胞凋亡率显著低于H2O2损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Imip预处理能显著减少氧化应激诱导的RGC-5细胞凋亡。第三部分丙咪嗪对氧化应激诱导的视网膜神经节细胞凋亡保护作用机制目的：探讨丙咪嗪对RGC细胞凋亡的保护作用是否与TrkB通路有关。方法：体外培养RGC-5细胞株,分为对照组和TrkB阻断组,两组均以5μmol/L的Imip预处理30min,加入H2O2处理1h后,TrkB阻断组加入TrkB功能性抗体阻断剂TrkB-IgG,阻断TrkB信号通路的激活,对照组中加入等效非特异性对照抗体NC-IgG作为对照。47h后,TUNEL法检测RGC-5的细胞凋亡情况。结果：TrkB阻断组细胞凋亡率显著高于对照组,两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Imip可能通过激活TrkB信号通路发挥细胞凋亡保护作用。