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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是引起猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)的病原菌。主要引起猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业带来了严重经济损失。根据APP荚膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同可将APP分为15个血清型，每个血清型的流行地区和毒力有所差别，我国主要流行1、2、3和7型。APP的主要毒力因子包括荚膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(Tbp)、RTX外毒素、粘附因子、尿酶、蛋白酶等。根据这些毒力因子的功能，研究人员开发了许多候选疫苗用来预防和控制该病。但用于临床的主要是灭活苗和亚单位疫苗，其免疫保护力有限，不能提供对不同血清型的交叉保护作用，所以迫切需要开发新型疫苗来预防和控制该病。病原分子生物学与致病机理的研究是新型疫苗设计和开发的基础，对APP感染过程相关基因进行研究是非常必要的。本课题构建了APP血清JL-03型菌株的基因组表达文库，制备了APP感染猪的康复血清，运用免疫学技术筛选到14个APP的体内诱导的抗原基因，并对部分体内诱导抗原基因进行了免疫原性研究。主要研究成果如下：
APP基因组表达文库的构建：提取APPJL-03型的基因组DNA，用Sau3AI酶切后回收0.5～2kb的片段，分别克隆到原核表达载体pET-28a/b/c中，转化宿主菌，构建了基因组表达文库。文库大小分别为2.50×104cfu/μL、1.91×104cfu/μL和2.12×104cfu/μL；文库重组质粒含有率大于60％，可以进行筛选研究。
血清抗体探针的制备：用非致死剂量5×105cfu攻毒猪只，收集康复血清，用硝酸纤维膜塑模分别吸附菌体抗原和分泌抗原，吸附4次后，ELISA检测血清吸附效果（OD630由1.23下降到0.16），且第3次和第4次基本无变化，即得到抗体探针，可用于文库筛选。分别地阳性重组质粒。
体内诱导抗原的筛选：用IPTG诱导表达文库蛋白，用免疫印迹方法进行文库筛选，筛选到11个克隆，对筛选到的阳性克隆测序，测得的序列用软件BLAST进行同源性比对，确定开放阅读框(ORF)，共包括14个ORF.
体内诱导抗原免疫原性验证：从14个ORF中选出3个在各血清型相对保守的基因，进行了克隆、表达、纯化并对其免疫原性进行了验证。将pkyA、purR3、mutT2三个基因克隆到表达载体pET-28a中，进行表达纯化，通过Western-blot验证，三个蛋白均是体内诱导表达的抗原。检测三个重组蛋白对小鼠的免疫保护力，以1,2，7型三价灭活苗和氢氧化铝佐剂为对照，将纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后，免疫小鼠3次，之后分别用APPJL-03和APP4074的2LD50(6×1015和1×1010)攻毒，其中在对APPJL-03的免疫保护力方面，PkyA、MutT2相对较好的，PurR3次之，对APP4074的保护力都较弱，但在对1型和3型的交叉免疫保护方面PurR3较好。