乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是一种新近克隆成功的葡萄糖醛酸内切酶，也是体内惟一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparin sulphate proteoglycan，HSPG）的内切糖苷酶，通过降解HSPG，破坏细胞外基质和基底膜结构，在肿瘤的浸润和转移中起重要作用。目前研究证明，Hpa mRNA和蛋白在多种恶性肿瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤及恶性黑素瘤等组织中的表达异常增高，并且证实其表达水平增高与肿瘤的侵袭、转移潜能以及患者的预后密切相关；最新研究显示，Hpa与卵巢癌、胃癌等肿瘤的生长、增殖及凋亡亦密切相关。但是，有关Hpa对恶性黑素瘤生长调控的相关研究，特别是以Hpa基因为靶点的反义寡核苷酸技术抑制恶性黑素瘤细胞生长的研究，国内外均未见文献报道。恶性黑素瘤（Malignant melanoma，MM）是一种常见的黑素细胞肿瘤，具有恶性程度高、极易发生早期侵袭和转移以及死亡率高等临床特点，在所有恶性肿瘤中占1％～2％。有资料显示，本病晚期患者的平均生存期仅为6～10月。近年来，世界范围内的恶性黑素瘤发病率呈明显增长趋势。2006年最新报告显示，黑素瘤已成为美国第7位最常见的恶性肿瘤；澳大利亚每年每10万人中有40～60例为新发病例；1981年～2000年间，我国皮肤恶性黑素瘤亦有明显增加，平均年增长率达3.9％。目前，虽然在Mohs显微外科手术、化疗、放疗以及免疫治疗等方面进行了大量的临床与实验研究，但疗效常不十分理想。因此，恶性黑素瘤的防治在医学领域始终是一个国际性的难题和研究热点。近年，随着反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）基因治疗技术的飞速发展，以其设计简单、合成容易、安全性高、特异性强等突出特点已成为肿瘤基因治疗研究领域的热点课题。为研究Hpa与恶性黑素瘤生长和肿瘤细胞增殖的关系，探讨恶性黑素瘤基因治疗的有效方法，本研究应用阳离子脂质体介导的乙酰肝素酶反义寡核苷酸（Hpa-ASODN）下调靶基因表达的治疗策略，采用细胞培养、异种移植瘤动物实验、RT-PCR、原位杂交和免疫组织化学等多种实验方法，对恶性黑素瘤中Hpa mRNA和蛋白的表达以及Hpa-ASODN对恶性黑素瘤肿瘤生长和肿瘤细胞增殖的影响及其机制进行了一系列体外和体内实验研究。本研究共分三个部分。第一部分恶性黑素瘤中乙酰肝素酶mRNA和蛋白表达的研究目的：观察良、恶性黑素细胞肿瘤中Hpa mRNA和蛋白表达的差异，探讨Hpa与恶性黑素瘤发生发展的关系。方法：1．采用原位杂交和免疫组织化学（SP法，AEC显色）两种实验方法在基因水平和蛋白水平上对30例恶性黑素瘤组织、人恶性黑素瘤A375细胞株、30例黑素细胞痣组织及15例正常皮肤组织中Hpa的mRNA和蛋白表达进行检测。2．采用SPSS10.0统计学软件进行χ²检验，检验标准α=0.05。结果：1．Hpa mRNA在组织和A375细胞中的表达：18例（60.00％，18／30）恶性黑素瘤组织及A375细胞的Hpa mRNA呈阳性表达，阳性信号呈蓝色颗粒，定位于胞浆，信号强度为阳性或强阳性；1例（3.33％，1／30）黑素细胞痣亦呈阳性表达，信号强度为弱阳性；正常皮肤组织均呈阴性表达。恶性黑素瘤组织Hpa mRNA的阳性表达率与黑素细胞痣及正常皮肤组织相比，均有显著性差异（χ₁²=22.259，P=0.000；X₂²=25.714，P=0.000）。2．Hpa蛋白在组织和A375细胞中的表达：19例（63.33％，19／30）恶性黑素瘤组织及A375细胞的Hpa蛋白呈阳性表达，阳性信号呈橘红色颗粒，定位于胞浆，信号强度为阳性或强阳性；2例（6.67％，2／30）黑素细胞痣皮损亦呈阳性表达，信号强度为弱阳性；正常皮肤组织均呈阴性表达。恶性黑素瘤组织Hpa蛋白的阳性表达率与黑素细胞痣和正常皮肤组织相比，均有显著性差异（χ₁²=21.172，P=0.000；χ₂²=27.805，P=0.000）。3．Hpa mRNA与其蛋白表达的关系：30例恶性黑素瘤皮损中，Hpa蛋白及mRNA表达均为阳性者18例（60.00％），均为阴性者11例（36.67％），两者表达一致率为96.67％（29／30）。第二部分乙酰肝素酶反义寡核苷酸体外抑制恶性黑素瘤A375细胞增殖的实验研究目的：观察Hpa-ASODN转染对体外培养的人恶性黑素瘤A375细胞增殖的影响，检测转染对A375细胞Hpa mRNA和蛋白表达的影响；筛选ASODN最佳有效序列，探讨Hpa-ASODN对A375细胞增殖的调控作用及可能机制，为裸鼠体内试验奠定基础。方法：1．设计、合成针对Hpa mRNA的ASODN-t1、ASODN-t2、ASODN-t3、ASODN-t4 4条反义寡核苷酸链和1条无关寡核苷酸链（N-ODN），制备各自10μmol／L、20μmol／L和30μmol／L浓度的寡核苷酸（ODN）阳离子脂质体包裹体，分别转染体外培养的恶性黑素瘤A375细胞株，以培养液代替ODN作为对照；2．采用倒置相差显微镜和常规HE染色观察每条链各浓度组转染后细胞的生长情况及形态学改变；采用台盼蓝排斥试验检测细胞增殖。3．采用原位杂交与免疫组织化学（SP法，AEC显色）两种实验方法检测转染后抑制细胞增殖最强序列的ASODN组（30μmol／LASODN-t2）、N-ODN组及对照组3组细胞Hpa mRNA和蛋白表达水平。4．数据用（?）±S表示，采用SPSS10.0统计学软件进行方差分析和q检验，检验水准α=0.05。结果：1．Hpa-ASODN转染对A375细胞生长和形态的影响：转染72h后，倒置显微镜观察显示，对照组细胞生长旺盛，细胞为多角形，排列紧密，呈“铺路石”样；HE染色显示，细胞大小不一，多角形，核浆比例增大，核深染，核仁清楚，可见核分裂相。N-ODN组生长情况和形态类似对照组，与上述两组相比，ASODN每条链各浓度组细胞生长缓慢，数量明显减少，但形态无明显改变。各组细胞中均未见色素颗粒。2．Hpa-ASODN转染对A375细胞增殖的抑制作用：台盼蓝排斥试验显示，各组细胞计数相比具有显著性差异（F=86.390，P=0.000）。进一步的两两比较显示，ASODN-t1、ASODN-t2、ASODN-t3、ASODN-t4各浓度组细胞数量与对照组相比均有显著性差异（P均=0.000）；4条ASODN的10μmol／L、20μmol／L、30μmol／L三个浓度组的细胞计数相比均有显著性差异（P均=0.000），其中，30μmol／LASODN-t2细胞数量与其它各组相比均有显著性差异（P均＜0.05），为最佳有效序列。3．Hpa-ASODN转染后A375细胞Hpa mRNA表达的改变：光镜下观察原位杂交结果，3组均可见到Hpa mRNA阳性表达，阳性信号呈蓝色细小颗粒定位于胞浆，其中对照组、N-ODN组的杂交信号强、着色深，且阳性细胞数多，即显示高表达，而30μmol／L ASODN-t2组杂交信号弱、染色淡，阳性细胞数也极少，即显示低表达。对照组、N-ODN组和ASODN-t2组的评分依次为4.250±0.500，4.000±0.817，1.250±0.500。方差分析显示，各组的评分相比有显著性差异（F=28.500，P=0.000）。进一步的q检验显示，对照组和N-ODN组相比无显著性差异（P=-0.585），而对照组和ASODN-t2组、N-ODN组和ASODN-t2组相比均有显著性差异（P₁，P₂均为0.000）。4．Hpa-ASODN转染后A375细胞Hpa蛋白表达的改变：3组均可见到Hpa蛋白阳性染色，呈红色颗粒状定位于胞浆，其中对照组、N-ODN组的染色深，阳性细胞数多，呈高水平表达，而ASODN-t2组的染色淡，阳性细胞数少，呈低水平表达。对照组、N-ODN组和ASODN-t2组的评分依次为5.000±0.817，4.500±0.577，1.000±0.527。方差分析显示，对照组和N-ODN组的评分相比无显著性差异（F=32.250，P=0.000）。进一步的q检验显示，对照组和N-ODN组相比无显著性差异（P=0.316），而对照组和ASODN-t2组、N-ODN组和ASODN-t2组相比均有显著性差异（P均=0.000）。第三部分乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤生长的抑制作用及机制研究目的：建立Hpa-ASODN转染的人恶性黑素瘤A375细胞异种移植瘤实验动物模型；观察Hpa-ASODN对裸鼠体内人恶性黑素瘤皮下移植瘤生长的影响；检测移植瘤Hpa mRNA和蛋白、VEGF和bFGF蛋白表达的改变，进一步探讨Hpa-ASODN对裸鼠体内人恶性黑素瘤移植瘤生长的抑制作用及可能机制。方法：1．选择25只雌性BALB／c裸鼠，每组5只，分为5组；分别采用10μmol／L、20μmol／L、30μmol／L ASODN-t2和30μmol／L N-ODN的阳离子脂质体转染人恶性黑素瘤A375细胞，用培养液代替ODN作为对照，以转染细胞皮下注射的方式进行裸鼠体内成瘤实验，建立人恶性黑素瘤A375细胞异种移植瘤动物模型；用游标卡尺测量并计算移植瘤体积；6周后处死荷瘤裸鼠，HE染色观察组织学形态。2．采用RT-PCR、原位杂交及免疫组织化学（SP法，DAB显色）三种实验方法检测上述5组移植瘤Hpa mRNA和蛋白表达的变化。3．采用免疫组织化学（SP法，DAB显色）方法检测30μmol／LASODN-t2组、30μmol／L N-ODN组及对照组肿瘤组织VEGF和bFGF蛋白表达水平的变化。4．数据用（?）±S表示，采用SPSS10.0统计学软件进行方差分析和q检验，检验水准α=0.05。结果：1．人恶性黑素瘤A375细胞株异种移植瘤动物模型的建立：将未转染和转染ODN的恶性黑素瘤A375细胞接种于裸鼠体内，结果25只裸鼠皮下均形成瘤体，异种移植成功率达100％，出瘤时间为4d～10d。2．转染后裸鼠皮下移植瘤的组织学表现：各组移植瘤组织HE染色后，光镜下观察可见大小不等的瘤细胞团，其中散在大小不等的灶状、片状凝固性坏死，瘤团周围有少量纤维间质包绕，未见色素颗粒。瘤细胞为多角形上皮样细胞，排列紧密，呈现明显异形性，即大小不一，形态各异，核大深染或淡染，后者核膜及核仁清晰（1～4个），病理性核分裂像常见。坏死灶依对照组、N-ODN组、10μmol／L、20μmol／L和30μmol／LASODN-t2组的顺序，其数量和大小依次增大。3．转染对裸鼠体内移植瘤生长的抑制作用：接种6周后方差分析显示，5组的移植瘤体积相比有显著性差异（F=8.228，P=0.000）；进一步两两比较显示，对照组与N-ODN组、10μmol／L与20μmol／LASODN-t2组移植瘤体积相比均无显著性差异（P均＞0.05）；而各ASODN-t2组与对照组、各ASODN-t2组与N-ODN组、30μmol／LASODN-t2组与其它各组移植瘤体积相比均有显著性差异（P均＜0.05）。处死后5组皮下移植瘤的肉眼观察显示，对照组与N-ODN组移植瘤大小相近，各ASODN-t2组均比对照组和N-ODN组的移植瘤小，以30μmol／L ASODN-t2组的移植瘤为最小。4．转染后裸鼠皮下移植瘤Hpa mRNA表达的改变4．1 RT-PCR检测结果：5组均可见Hpa mRNA阳性表达；对照组与N-ODN组的表达最强，且强度接近；各ASODN-t2组表达强度较弱，且10μmol／L、20μmol／L和30μmol／L ASODN-t2组的表达强度依次减弱。方差分析显示，5组的评分相比有显著性差异（F=92.231，P=0.000）；进一步两两比较显示，除对照组与N-ODN组Hpa mRNA表达水平相比无显著性差异外（P均＞0.05），其余各组间两两比较，Hpa mRNA表达水平均有显著性差异（P均＜0.05）。4．2原位杂交检测结果：光镜观察显示，5组均可见Hpa mRNA阳性表达，阳性信号呈蓝色细小颗粒定位于胞浆；对照组与N-ODN组Hpa mRNA的表达信号最强，且两者阳性细胞数、表达强度相接近；与对照组和N-ODN组相比，各ASODN-t2组Hpa mRNA的表达信号较弱，阳性细胞数明显减少，其中以30μmol／LASODN-t2组阳性细胞数为最少，表达强度也最低。方差分析显示，5组的评分相比有显著性差异（F=90.392，P=0.000）；进一步两两比较见显示，对照组与N-ODN组、10μmol／L与20μmol／L ASODN-t2组Hpa mRNA表达水平相比均无显著性差异（P均＞0.05）；而各浓度ASODN-t2组与对照组、各浓度ASODN-t2组与N-ODN组、30μmol／L ASODN-t2组与其它各组HpamRNA表达水平相比均有显著性差异（P均＜0.05）。5．转染后裸鼠移植瘤Hpa蛋白表达的改变：5组均可见Hpa蛋白阳性染色，呈棕黄色颗粒状定位于胞浆；各组表达阳性细胞数、表达强度与原位杂交结果类似。方差分析显示，5组的评分相比有显著性差异（F=76.257，P=0.000）；进一步两两比较显示，对照组与N-ODN组、10μmol／L与20μmol／L ASODN-t2组Hpa蛋白表达水平相比均无显著性差异（P均＞0.05）；而各ASODN-t2组与对照组、各ASODN-t2组与N-ODN组、30μmol／L ASODN-t2组与其它各组Hpa蛋白表达水平相比均有显著性差异（P均＜0.05）。Hpa蛋白与mRNA的表达相比，二者的结果呈明显的一致性。6．转染后裸鼠移植瘤VEGF蛋白表达的改变：3组均可见VEGF蛋白的阳性染色；对照组与N-ODN组VEGF蛋白的染色强度最强，而30μmol／L ASODN-t2组VEGF蛋白的染色强度明显减弱。方差分析湿示，3组的评分相比有显著性差异（F=25.194，P＜0.001）；进一步两两比较显示，对照组与N-ODN组VEGF蛋白表达水平相比无显著性差异（P＞0.05），而30μmol／L ASODN-t2组与对照组、30μmol／LASODN-t2组与N-ODN组的VEGF蛋白表达水平相比均有显著性差异（P均＜0.05）。7．转染后裸鼠移植瘤bFGF蛋白表达的改变：3组均可见bFGF蛋白的阳性染色；对照组与N-ODN组bFGF蛋白的染色强度最强，30μmol／L ASODN-t2组bFGF蛋白的染色强度明显减弱。方差分析显示，3组的评分相比有显著性差异（F=14.807，P＜0.005）；进一步两两比较显示，对照组与N-ODN组bFGF蛋白表达水平相比无显著性差异（P＞0.05），而30μmol／LASODN-t2组与对照组、30μmol／LASODN-t2组与N-ODN组的bFGF蛋白表达水平相比均有显著性差异（P均＜0.05）。结论1．恶性黑素瘤组织中Hpa mRNA和蛋白均呈高表达，其阳性表达率均显著高于黑素细胞痣和正常皮肤，且Hpa mRNA和蛋白的阳性表达高度一致。提示Hpa在恶性黑素瘤的发生、发展过程中可能起着重要作用，有可能成为恶性黑素瘤的诊断指标及治疗靶点之一。2．首次检测了恶性黑素瘤A375细胞株中Hpa mRNA和蛋白的表达，结果显示其Hpa mRNA和蛋白亦呈高表达，表明该细胞株可作为体内外研究恶性黑素瘤与Hpa关系的靶细胞系。3．Hpa-ASODN对体外培养的A375细胞增殖有抑制作用，且有浓度依赖效应，证明Hpa-ASODN具有体外抗恶性黑素瘤的活性。4．Hpa-ASODN可下调A375细胞Hpa mRNA和蛋白的表达，提示Hpa的表达下调可能是引起A375细胞增殖抑制作用机制之一。5．首次成功建立了A375细胞裸鼠皮下移植瘤模型，提示该裸鼠移植瘤模型可作为今后研究恶性黑素瘤与Hpa关系的动物模型。6．率先证实Hpa-ASODN可明显抑制裸鼠移植瘤生长，并可下调裸鼠移植瘤组织中Hpa mRNA和蛋白的表达，提示Hpa-ASODN具有体内抗恶性黑素瘤的作用。7．首次发现Hpa-ASODN可下调裸鼠移植瘤组织中VEGF和bFGF的表达，提示Hpa-ASODN可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。8．Hpa-ASODN的抗恶性黑素瘤的作用机制不仅与其ASODN抑制恶性黑素瘤肿瘤细胞增殖有关，而且可能与Hpa-ASODN抑制肿瘤血管生成有关，为以后Hpa作为靶点治疗恶性黑素瘤提供了理论依据。