慢性间断性酒精暴露大鼠不同脑区MMP-9的表达及突触超微结构的改变

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:haifeng123456789
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目的:通过建立慢性酒精暴露的大鼠模型,应用实时荧光定量PCR,蛋白质免疫印迹(Western blot),透射电镜和IP-MS技术等实验手段,观察成瘾与学习记忆相关脑区(海马、内侧前额叶皮层和杏仁核)基质金属蛋白酶MMP-9的表达情况以及这些脑区突触超微结构的改变,并通过寻找MMP-9相互作用蛋白,探讨MMP-9在慢性酒精暴露过程中的作用及可能机制,为进一步揭示酒精暴露导致的成瘾记忆和行为提供新的理论依据。方法:将七周龄的雄性大鼠随机分为以下三组:酒精组(EtOH)、麦芽糖组(Maltose)、自由饮食对照组(Chow)。对大鼠给予间断性灌胃,连续灌胃两天,戒断两天,依此类推,直至第28天。酒精组每天灌酒精(4 g/kg)、麦芽糖组每天灌同酒精组相等热量的麦芽糖(7 g/kg)、自由饮食对照组每天自由饮水。然后在模型建立过程当中的7个时间点(第0、2、4、14、16、26、28天)取海马、mPFC和杏仁核组织进行后续实验:(1)血液酒精浓度和体重测定:在灌胃后30 min内采用大鼠尾静脉取血的方法取少量新鲜血液0.2 ml,随后立即用顶空气相色谱法测定血液中酒精浓度。(2)用实时荧光定量PCR的方法测定大鼠海马、mPFC、杏仁核组织在CIE的不同阶段MMP-9 mRNA的表达量。(3)用蛋白质免疫印迹Western Blot的方法测定大鼠海马、mPFC、杏仁核等组织在CIE的不同阶段MMP-9蛋白的表达量。(4)利用透射电镜观察经慢性间断性酒精暴露后,海马、mPFC、杏仁核突触的界面结构较对照组的改变情况。(5)用IP-MS/MS方法分析在CIE模型中海马脑区与MMP-9相互作用的蛋白。结果:(1)建立慢性间断性酒精暴露模型,对酒精组大鼠在连续灌胃两天后、戒断两天后的同一时间点(每次灌酒精选取相同时间点),即在初始灌酒精第2天、第4天、第14天、第16天、第26天、第28天,进行尾静脉采血测定血酒精浓度(blood ethanol concentration,BEC)。结果显示,与对照组相比,当天灌酒精组血酒精浓度明显升高(P<0.01)。在整个模型建立期间,三组大鼠体重都逐渐增高,各组之间没有显著差异。表明模型建立成功。(2)荧光定量PCR实验结果显示,与对照组相比,在海马组织中,MMP-9的mRNA表达量从酒精急性暴露阶段即Day 2开始增高(P<0.01),在慢性酒精暴露早期即Day 14(P<0.01),在慢性酒精暴露晚期即Day 26(P<0.01),MMP-9的mRNA表达也呈升高状态。同时,在酒精戒断阶段即Day 4、Day 16、Day 28三个时间点,MMP-9 mRNA的表达量同样升高(P<0.05)。在mPFC中,MMP-9 mRNA的表达量也出现类似的从Day 2开始持续到Day 28的升高的情况,在Day 2(P<0.05)、Day 4(P<0.05)、Day 14(P<0.05)、Day 16(P<0.05)、Day 26(P<0.05)、Day 28(P<0.05)。在杏仁核脑区,MMP-9 mRNA的表达量较对照组均无显著差异。但是,在杏仁核中检测到MMP-2的mRNA表达量较对照组有升高。在麦芽糖组中,三个脑区的七个时间点的检测显示,MMP-9 mRNA的表达量与对照组相比无显著差异。(3)蛋白质免疫印迹(Western blot)的结果显示,与Day 0相比,海马组织中Total MMP-9及其活性形式Active MMP-9的蛋白表达量从急性戒断期即Day 4开始明显升高(P<0.05),逐步上升并一直持续到Day 28(P<0.01)。在mPFC中,与Day 0相比,Total MMP-9的蛋白表达从慢性暴露的早期(Day 14)开始明显增高(P<0.01)。在慢性戒断的早期(Day 16)(P<0.05),在慢性暴露的晚期(Day 26)(P<0.01)和慢性戒断的晚期(Day 28)(P<0.01)均明显升高。Active MMP-9的蛋白表达在慢性暴露的早期(Day 14)最早出现明显升高(P<0.05),而后在慢性暴露和戒断的晚期明显升高即Day 26(P<0.05)、Day 28(P<0.01)。(4)透射电镜结果显示,与对照组即Day 0相比,在CIE酒精暴露后期的海马、mPFC、杏仁核这三个脑区均有突触界面曲率增大,突触后膜致密物厚度增加,突触前后膜之间的间隙增大的现象。(5)通过蛋白质免疫共沉淀及质谱分析方法筛选找到,在慢性酒精间断性暴露期间与MMP-9发生相互作用的一些蛋白,包括Itgb1、Src、Eef1a、微管蛋白(Tubulin)、肌动蛋白(Actin)和组蛋白H2B(Histone H2B)等。结论:(1)在大鼠海马和mPFC组织中,慢性酒精间断性暴露后MMP-9的mRNA和蛋白表达量均明显升高,而在杏仁核中MMP-9的表达量无显著性差异。同时,MMP-2的mRNA表达在杏仁核中有升高。(2)慢性酒精间断性暴露导致大鼠海马、mPFC、杏仁核等脑区神经元突触超微结构突触界面曲率增大、突触后膜致密物厚度增加、突触间隙增大。(3)我们找到一些在慢性酒精暴露过程中MMP-9的相互作用蛋白,为下一步的分子机制研究提供了实验基础。
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