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在肿瘤治疗中，应用电离辐射和肿瘤化疗药物等DNA损伤剂诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的主要策略。野生型p53是DNA损伤后细胞应激反应中决定细胞生死命运的关键调控因子。DNA损伤反应引发p53发生磷酸化等一系列化学修饰，从而使得p53稳定性增强并累积，转录激活或抑制下游基因表达。DNA损伤反应中p53稳定性和转录活性的升高精密地依靠多个位于脯氨酸前的丝、苏氨酸残基的磷酸化。研究进展表明，那些被磷酸化修饰的Ser-/Thr-Pro基序还受到肽基—脯氨酰顺/反异构酶即Pin1的调控。Pin1特异催化肽-脯氨酰间肽键发生顺反异构化，诱导底物发生构象改变，进而调控其化学修饰、稳定性、亚细胞定位以及与其它蛋白的相互作用。先前基于正常细胞的研究表明，在电离辐射、紫外照射等引发的DNA损伤反应中，Pin1与磷酸化的p53结合并调控增强p53的稳定性和转录激活能力。然而其细胞学后果却还存在存在着相互矛盾的实验事实，表现为：一方面Pin1通过维持细胞周期检查点机制避免细胞凋亡，另一方面Pin1通过增强促凋亡基因表达促进细胞凋亡。对于肿瘤细胞DNA损伤反应中Pin1如何调控p53的稳定性和凋亡诱导功能目前还不清楚。这是因为Pin1在多种肿瘤组织中异常高表达，促进细胞增殖和转化，是肿瘤发生、发展的“催化剂”。Pin1的这种功能与p53的肿瘤抑制作用相互拮抗。已有报道，肿瘤细胞中p53被癌基因类激酶修饰后产生pSer-/Thr-Pro基序，正是Pin1结合所需位点。那么肿瘤细胞非应激状态下Pin1与p53是否存在相互作用?Pin1是否对p53起负调控作用?由于泛素化E3-连接酶Mdm2是p53的主要负调控分子，它介导p53经由泛素化蛋白酶体途径降解。那么，在肿瘤细胞中Pin1是否通过促进Mdm2对p53的降解而对p53发挥负调控作用?在肿瘤细胞DNA损伤反应中，p53分子中可能产生多个满足Pin1结合所需的磷酸化Ser-/Thr-Pro基序，Pin1是否通过与之结合并调控p53构象，进而抑制p53-Mdm2相互作用，增强p53稳定性和转录激活能力，促进细胞凋亡?Pin1对不同DNA损伤剂顺铂、电离辐射以及阿霉素等诱导的肿瘤细胞凋亡反应有何影响?据此，本研究针对上述问题进行探索，并取得了以下研究进展：1．选用Pin1过表达的人乳腺癌细胞系MCF-7，采用载体介导的RNA干涉技术成功构建了稳定抑制Pin1表达的MCF-7细胞模型，为在肿瘤细胞中开展Pin1功能研究打下了良好基础。2．利用该模型研究发现：在非应激条件下Pin1可通过促进p53与MDM2结合降低p53稳定性，对p53发挥负调控作用。Westernblot和RT-PCR检测发现，Pin1 knockdown导致p53蛋白表达水平升高，而mRNA表达无明显变化。说明Pin1对p53表达水平的调控是蛋白水平而不是转录水平的调控。免疫荧光显示Pin1与p53在MCF-7细胞中能够共定位，免疫共沉淀实验证明非应激条件下MCF-7细胞中p53的Ser315（-Pro316）位存在磷酸化修饰，并且Pin1与p53存在相互作用。研究还发现，Pin1 knockdown导致p53与MDM2结合减少，因此部分增强了p53稳定性。上述结果说明在非应激条件下Pin1与p53结合后通过改变其构象，促进了p53与具有E3连接酶功能的MDM2结合，进而促进其对p53的泛素化降解，降低了p53稳定性。3．在研究顺铂处理引发的DNA损伤反应中发现：Pin1是顺铂所致DNA损伤反应中抑制Mdm2与p53结合及其介导的泛素化降解，增强p53稳定性的重要正调控因子。Pin1 knockdown导致p53蛋白稳定性受到显著损害，累积降低。免疫共沉淀实验证明，顺铂处理12h显著地抑制Mdm2与p53的结合，导致p53累积增加；而Pin1 knockdown细胞中Mdm2与p53的结合量明显高于对照细胞，p53累积则显著降低，表明Pin1在DNA损伤反应中通过抑制p53与Mdm2的相互作用，促进增强p53稳定性和累积，发挥重要的正调控作用。电离辐射处理得到了类似的结果。4．用p53下游靶基因p21WAF/cipl启动子构建的荧光素酶报告载体实验揭示，Pin1 knockdown导致p53的转录激活能力显著降低。干涉Pin1后，p53转录激活能力降低了60％左右。同时进行外源p53过表达的实验更进一步证明，即使在p53表达水平很高的情况下，当Pin1 knockdown时，p53的转录激活能力仍然很低，可能的原因是，Pin1 knockdown时高表达水平的p53并不能有效地与靶基因启动子结合，因此转录激活靶基因的能力显著下降，说明Pin1可能主要是通过促进p53与下游靶基因启动子的结合来增强p53转录激活能力。在顺铂以及电离辐射处理后对内源性p53下游基因表达的检测同样证明了，Pin1 knockdown导致p53转录激活细胞周期抑制基因p21WAF/cipl和促凋亡基因Bax的能力受到显著损害。5．利用流式细胞术检测Pin1 knockdown对p53诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡的影响，研究发现，Pin1干涉导致MCF-7细胞S期阻滞明显降低，表明p53激活DNA复制检查点的能力受到损害，这与干涉Pin1后p21WAF/cipl表达水平显著下降的结果相一致。同时还发现，Pin1干涉细胞经顺铂处理诱发的细胞凋亡减少约50％，表明Pin1干涉严重抑制顺铂诱导的MCF-7细胞凋亡，这与促凋亡基因Bax表达下降相一致。6．为了考察Pin1在不同DNA损伤剂处理条件下的作用，检测了拓扑异构酶Ⅱ类化疗药物阿霉素处理后p53表达水平的变化，结果显示，与顺铂、电离辐射处理后的变化不同，与对照细胞比较Pin1干涉细胞p53表达水平明显升高，p53下游抗凋亡基因Survivin的表达下降。台盼蓝染色计数死细胞显示，Pin1干涉细胞死亡率增高10％，Giema染色显示凋亡核显著增加。上述结果表明，在阿霉素处理中Pin1调控p53稳定性及功能活化的机制与顺铂、电离辐射处理时不同，Pin1 knockdown对阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡有一定的增敏作用，可能与Pin1 knockdown后凋亡诱导基因p53表达升高，抗凋亡蛋白Survivin表达下降有关，其详细的作用机制尚需进一步深入研究。7．研究进展揭示：由于p53-Survivin通路是DNA损伤剂阿霉素等有别于顺铂诱导细胞凋亡的一条基本通路，抗凋亡蛋白Survivin的表达受到p53转录抑制调控，而Pin1 knockdown后p53表达水平增高，因此检测了Pin1干涉前后Survivin表达的变化。结果表明，Pin1干涉后Survivin mRNA表达水平没有变化，而蛋白表达水平显著降低，半衰期缩短，说明Pin1干涉后Survivin蛋白表达水平降低不是由于p53转录抑制Survivin基因表达引起的，而是Pin1干涉降低Survivin稳定性的结果。Pin1干涉后导致抗凋亡蛋白Survivin表达降低可能是Pin1干涉对阿霉素诱导的MCF-7细胞凋亡起增敏作用的原因之一。这一结果也提示Pin1可能通过增强肿瘤细胞抗凋亡蛋白Survivin的稳定性来发挥抗凋亡作用。综上，通过对肿瘤细胞中Pin1的功能研究发现：一方面，Pin1在顺铂引发的DNA损伤反应中通过抑制具有E3连接酶功能的Mdm2与p53的结合及其介导的泛素化降解，增强p53稳定性和转录激活下游凋亡相关基因的能力，促进顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。另一方面，在肿瘤细胞非应激状态下Pin1又参与促进Mdm2与p53的结合及其介导的p53泛素化降解，对p53稳定性发挥负调控作用。此外，干涉Pin1对阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡具有一定的增敏作用，其可能的机制是，干涉Pin1提高凋亡诱导蛋白p53的稳定性和表达水平，同时降低抗凋亡蛋白survivin的稳定性和表达水平，促进阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡。取得的研究进展对于深入认识Pin1在DNA损伤反应中调控p53稳定性和肿瘤细胞凋亡诱导能力的机制以及开展以DNA损伤诱导肿瘤细胞凋亡为策略的肿瘤治疗具有重要的理论指导和潜在的临床指导意义。