高血压及其所引发的其他心血管并发症如脑卒中、冠心病和心梗等已经成为人类致死和致残的最大威胁之一。在广泛的开展了各级高血压预防措施的情况下,其发病率居高不降,提示仍有未被发现的重要病因。血管重构是血管内膜增厚、内径缩窄以及血管内部胞外基质增多的过程,主要涉及细胞的肥大、增殖、迁移、凋亡以及胞外基质的生成与降解紊乱。传统观点认为血管重构是高血压的继发性改变;但本课题组前期研究中发现,血管重构也可能是高血压发生的重要病因。因此,深入探索孕期炎症刺激子代动物血管重构发生的分子机制,已成为一个迫切需要解决的重要科学问题。mTOR信号通路可被包括炎症、生长因子、激素等激活,在整合了上游的多种信号后,通过其复合物向下传递包括调控细胞蛋白和脂质合成、能量代谢、细胞存活及代谢、细胞骨架构成等功能,在细胞的增殖、迁移等生命活动上作用重大。结合课题组既往研究发现孕期炎症刺激后子代大鼠炎症反应性增强、循环中leptin、TNF-α、IL-6及血管组织局部AngII、TNF-α等促炎因子水平显著升高,我们推测mTOR的异常活化可能参与了孕期炎症刺激致子代动物血管重构的形成、进而导致高血压的发病。为此,本课题在孕期炎症刺激致子代高血压的基础上,系统评价mTOR异常活化对主动脉血管重构的影响并初步揭示相关的分子机制,探讨高血压致病的新机制并为其防治新靶标的寻找提供实验依据。方法:1.孕期炎症刺激后子代大鼠不同时期mTOR信号通路活性改变规律复制孕期炎症暴露于脂多糖(LPS)大鼠模型:孕鼠(SD大鼠)随机分成两组:对照组、LPS组,其中LPS组于孕第8、10、12天腹腔注射LPS(0.79mg/kg),对照组于孕第8、10、12天腹腔注射生理盐水。子代出生后监测基础体征;Western blot检测子代大鼠1w、3w、5w、10w、15w、26w胸主动脉mTORC1下游信号通路p-S6ser240/244以及mTORC2下游信号通路p-Aktser473的蛋白表达水平;2.mTOR抑制剂雷帕霉素对孕期炎症刺激后子代大鼠血压、血管重构及内皮功能的影响2.1 mTOR通路在体干预:将26周龄子代大鼠分为四组:Con+Ve、LPS+Ve、Con+Rapa、LPS+Rapa组,注射溶剂或雷帕霉素(1.5mg/kg/day)15天。尾套法检测给药期间血压。干预至15天,取胸主动脉,HE染色观察给予雷帕霉素干预后胸主动脉形态学的改变;Masson染色观察胸主动脉胶原纤维的变化;2.2 western blot检测孕期刺激子代大鼠26周龄胸主动脉p-e NOS、PCNA的表达情况以及给予雷帕霉素干预后的影响;3.孕期炎症刺激后子代小鼠mTOR信号通路活性观察及血管平滑肌细胞敲低mTORC1活性对孕期炎症刺激后子代小鼠血压、血管重构的影响3.1孕期炎症暴露于脂多糖小鼠(c57)模型:于孕10.5天腹腔注射LPS(75μg/kg)或生理盐水。子代出生后监测基础体征;WB检测子代小鼠16周龄胸主动脉mTORC1下游信号通路p-S6ser240/244以及mTORC2下游信号通路p-Aktser473的蛋白表达水平;3.2孕期炎症刺激血管平滑肌细胞mTORC1条件性敲低小鼠试验:Itagx-cre小鼠与Raptor-floxp交配后F2代进行基因鉴定,取基因型为ItagxcreRaptorfl/wt小鼠复制孕期炎症刺激小鼠模型,检测子代小鼠血压情况;HE染色观察其胸主动脉形态结构的改变;4.肾素血管紧张素系统(RAS)异常在孕期炎症刺激后子代mTOR信号通路活性异常的作用4.1 ACE抑制剂盐酸贝那普利(饮水中250mg/L,40mg/kg/day)饮水给予15天耗竭内源性Ang II后检测胸主动脉mTORC1信号通路中p-S6ser240/244以及mTORC2信号通路中p-Aktser473的蛋白表达水平;4.2 ACE抑制剂盐酸贝那普利(饮水中250mg/L,40mg/kg/day)饮水给予15天耗竭内源性Ang II后再次给予外源性Ang II(105μg/kg)皮下注射后分别于0min,2min,5min,10min,30min,取胸主动脉,检测胸主动脉mTORC1信号通路中p-S6ser240/244以及mTORC2信号通路中p-Aktser473的蛋白表达水平;结果:1.孕期炎症刺激后子代大鼠不同时期mTOR信号通路活性改变规律孕期炎症刺激子代大鼠1周、3周、5周、10周、15周胸主动脉mTORC1下游信号通路p-S6ser240/244的表达均呈现上升趋势,至26周龄p-S6ser240/244的表达显著增高(P<0.01),但mTORC2下游信号通路p-Aktser473的表达未出现明显变化;2.mTOR抑制剂雷帕霉素对孕期炎症刺激后子代大鼠血压、血管重构及内皮功能的影响2.1孕期炎症刺激子代大鼠个体26周时血压显著升高(P<0.01,与Con组相比),给予雷帕霉素干预后,部分逆转了孕期炎症刺激所导致的血压升高(P<0.0001);2.2 HE染色观察到,与Con+Ve组相比,LPS+Ve组胸主动脉内皮层完整性受损,内弹力膜被破坏不连续,平滑肌细胞排列紊乱,向内皮层凸起,并且室壁厚度显著增厚(P<0.05),胸主动脉面积明显增加(P<0.05),以及室壁厚度与内径比值也显著增加(P<0.05),给予雷帕霉素干预后均能部分逆转上述现象;2.3 Masson染色观察到,LPS+Ve组胸主动脉胶原沉积显著增加(P<0.05,与Con+Ve组相比),给予雷帕霉素干预(LPS+Rapa组)后能明显抑制孕期炎症刺激所导致的子代胶原沉积的增加(P<0.05,与LPS+Ve组相比);2.4孕期炎症刺激子代个体26周龄胸主动脉低表达p-eNOS,给予雷帕霉素干预后能够部分逆转p-e NOS的低表达;2.5孕期炎症刺激子代个体26周龄胸主动脉高表达PCNA,给予雷帕霉素干预后能够部分缓解PCNA的异常表达;3.孕期炎症刺激后子代小鼠mTOR信号通路活性观察及血管平滑肌细胞敲低mTORC1活性对孕期炎症刺激后子代小鼠血压、血管重构的影响3.1孕期炎症刺激子代小鼠16周龄胸主动脉mTORC1信号通路中p-S6ser240/244的表达显著增加(P<0.05,与正常子代小鼠相比),mTORC2信号通路中p-Aktser473的表达无显著差异;3.2相较于正常出生的子代小鼠,孕期炎症刺激子代小鼠57周时血压显著升高,主动脉室壁厚度增加,同时内皮层凸起;而mTORC1在血管平滑肌上的敲低可以显著地恢复孕期炎症刺激所导致的血压升高,血管室壁厚度恢复正常,同时内皮层也相对较为光滑,血管重构得以改善;4.肾素血管紧张素系统(RAS)异常在孕期炎症刺激后子代mTOR信号通路活性异常中的作用4.1孕期炎症刺激子代大鼠26周龄,贝那普利干预15天后能降低孕期炎症刺激所导致的血压增高。同时贝那普利干预15天后,Con+BZ组与LPS+BZ组相比,胸主动脉mTORC1下游信号通路p-S6ser240/244无显著差异。结合我们前期发现的孕期炎症刺激子代大鼠血管组织局部Ang II显著增加而循环中Ang II无显著变化,提示血管组织局部内源性Ang II水平增高是孕期炎症刺激后子代大鼠mTORC1信号异常增高的重要原因;4.2孕期炎症刺激子代大鼠26周龄,贝那普利干预15天后再次皮下注射外源性AngII 2min、5min、10min、30min,发现p-S6ser240/244的表达会随着Ang II给药时间的增加而增加,提示Ang II可以使mTORC1活化;但对照组与LPS组之间p-S6ser240/244的表达无差异,p-Aktser473的表达也无差异。提示孕期炎症刺激导致子代大鼠mTOR信号通路的异常并非对Ang II在体内反应性的改变所引起。结论:1.孕期炎症刺激致子代大鼠和小鼠胸主动脉均存在mTORC1异常活化,而mTORC2无显著改变;2.子代大鼠和小鼠胸主动脉mTORC1异常活化是孕期炎症刺激子代血管重构和血压升高的重要因素;3.血管局部Ang II显著增加是子代大鼠胸主动脉mTORC1异常活化的重要因素。