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皮肤作为天然免疫的第一道防线,在抵抗外来微生物感染中发挥着重要的作用。皮肤一方面构成了抵御病原体的物理屏障;另一方面,可分泌许多细胞因子、趋化因子和抗菌肽等,从而介导天然免疫和获得性免疫,利于病原体的清除,但是确切的细胞识别防御机制仍不清楚。Toll样受体(TLRs)家族是新近发现的哺乳动物构型识别受体(PRRs),介导识别病原体的主要分子结构(PAMPs),在天然免疫系统中起着非常重要的作用。其中TLR2和TLR4分别参与革兰氏阳性细菌肽聚糖和革兰氏阴性细菌脂多糖的识别,TLR9主要存在于抗原递呈细胞(APC)表面,特异识别存在于细菌基因组中的CpG motif。TLR9与CpG motif结合后被激活,通过Toll/IL-1R信号通路向下游传导信号,最终激活NF-κB、JNK、P38、ERK等转录因子,上调抗原递呈细胞表面MHC I、II类分子及共刺激分子的表达,促进APC的抗原递呈能力,并诱生多种急性炎症因子如IL-1、IL-6、IL-12和TNF-( 等。因此,CpG DNA与TLR9的相互作用是介导天然免疫与获得性免疫的重要桥梁。近年研究发现,皮肤正常状态下表达TLR2和TLR4, 在皮肤抵抗细菌导致的感染中发挥了重要的作用,但作为特异识别细菌CpG motif的受体TLR9在皮肤中是否表达及其如何发挥作用则不清楚。为此,本文首先采用RT-PCR和原位杂交方法检测正常生理状态下小鼠外耳皮肤TLR9 mRNA的表达,结果发现小鼠正常皮肤不表达TLR9 mRNA。为了研究皮肤TLR9 mRNA是否可诱导表达,半定量RT-PCR检测皮内注射20(l生理盐水、含CpG motif 的寡核苷酸(ODN)或质粒pYQF-2CpG/s 6、9小时皮肤TLR9 mRNA的表达,结果发现三组均可诱生皮肤表达TLR9 mRNA,且表达量无显著性差异。进一步研究发现皮肤TLR9 mRNA的表达呈注射时间和体积的依赖性。15(l生理盐水或细菌CpG motif注射6小时后,小鼠外耳皮肤均能检测到TLR9 mRNA, 12小时后消失;诱生皮肤TLR9 mRNA表达的最小注射剂量为15(l,当剂量增加到20(l时,TLR9 mRNA的表达水平也相应增加。原位杂交和H&E染色提示,皮肤TLR9 mRNA阳性细胞可能为炎性浸润细胞。为了进一步<WP=5>明确这些TLR9阳性细胞的功能,半定量RT-PCR方法检测了20(l生理盐水、GpC ODN、含CpG motif的ODN或质粒pYQF-2CpG/s皮内注射后各时间段急性炎性因子mRNA的表达。结果发现,皮内注射CpG motif能显著促进皮肤急性炎性因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-( mRNA的表达。上述结果提示,皮肤在正常状态下不表达TLR9,皮内注射引起的物理损伤可诱导皮肤表达TLR9,并介导对CpG motif的识别,释放急性炎性因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-(,促进皮肤Th1型微环境的形成。根据以上结果,推测皮肤TLR9 mRNA阳性可能为表达TLR9的炎性细胞的一过性浸润,而非皮肤自身细胞的从头合成。研究这部分TLR9阳性细胞在皮肤物理损伤后的趋化、归巢及其对区域淋巴结微环境的影响,以及CpG motif在其中的作用有助于阐明TLR9在皮肤天然免疫中的作用,为此本文通过Real-time PCR的方法检测小鼠外耳20ul生理盐水、GpC ODN或CpG ODN皮内注射后各时间段皮肤CCR5、CCR6、CCR7和CXCR4 mRNA的含量,及区域淋巴结(耳淋巴结)IL-4、IL-10、IL-12和IFN-( mRNA的含量。CCR5、CCR6是不成熟外周血单个核细胞进入外周组织时表达的趋化因子受体,CCR7、CXCR4仅在外周血单个核细胞受刺激成熟后表达,与其归巢至淋巴结有关。IL-4和IL-10是促进Th2免疫反应的细胞因子,而IL-12和IFN-(是促进Th1免疫反应的重要细胞因子。实验结果发现皮内注射6、9小时后各组皮肤均表达趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7和CXCR4 mRNA,其中CpG ODN可显著上调皮肤CXCR4 mRNA的表达,各组耳淋巴结均可检测到IL-12 mRNA,CpG ODN组诱生淋巴结IL-12 mRNA的含量显著高于其余两组,三组IL-4、IL-10和IFN-( mRNA表达则很弱。该结果进一步提示物理损伤所致皮肤TLR9阳性为表达TLR9的炎性细胞的一过性浸润,CpG motif促进皮肤表达CXCR4 mRNA,利于TLR9阳性细胞归巢,促进淋巴结表达IL-12 mRNA,提供了Th1型免疫反应的微环境。上述实验结果提示皮肤被外来细菌感染后,炎症水肿可诱发皮肤一过性表达TLR9,在皮肤和淋巴结内产生Th1型免疫反应的微环境,利于细菌DNA的清除,为阐明TLR9在皮肤天然免疫中的作用提供了理论依据,同时也有助于阐明CpG motif在基因枪接种DNA疫苗中促进Th1型免疫反应的机理。