卵泡发育是一连续的过程,一般可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段,初级卵泡和次级卵泡统称为生长卵泡。在卵泡发育的最早阶段,卵母细胞增大,卵母细胞周围形成颗粒细胞。当卵母细胞胞质的量增加时,卵泡发育将集中向颗粒细胞进行增殖和分化,这将驱动初始卵泡的窦腔形成,即窦卵泡。继而在卵泡刺激素(FSH)作用下,卵泡从早期窦卵泡发育至排卵前阶段。随着卵泡腔形成,颗粒细胞逐步分化成两种不同类型:壁颗粒细胞(mural granulosa cells,MGCs),分布在卵泡腔周边;卵丘细胞(cumulus cells,CCs),细胞呈柱状,紧贴透明带。卵母细胞与CCs形成卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。维持卵母细胞发育所需的能量代谢和生物合成物质大都来源于周围的CCs,表明CCs与卵母细胞之间存在紧密的相互交流:一方面,CCs通过缝隙连接向卵母细胞输送小分子物质,如环磷酸腺苷(cAMP)等,维持卵母细胞减数分裂阻滞;另一方面,卵母细胞通过旁分泌因子促进CCs增殖和扩展。由于,卵母细胞缺乏能量代谢所需相关酶,需要CCs为其生长提供必要的营养物质,如丙酮酸、谷胱氨酸等;反过来,卵母细胞通过旁分泌因子促进CCs上相关代谢酶的合成。卵丘细胞-卵母细胞之间紧密有序的相互交流作用,对于卵母细胞的发育和后续胚胎的形成至关重要。此外,CCs也有利于卵母细胞受精过程中对精子的捕获、选择和获能以及阻止透明带的过早硬化。这提示在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中CCs上存在诸多印记,即研究分析CCs上表达的相关基因可以间接反应卵母细胞质量和胚胎发育潜能,以提高临床妊娠率,可望作为预测卵母细胞质量和胚胎发育潜能的一种非侵入性方法。我们前期研究发现IVM过程中随着卵母细胞的成熟,MII期CCs上调的基因主要参与基质金属蛋白酶和表皮生长因子受体结合等事件,下调的基因主要参与细胞核内相关功能,对其中4个基因(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2)的初步功能研究发现这些基因与卵母细胞成熟及质量相关。此外我们也发现往IVM培养液中添加抗苗勒管激素(AMH)可以促进与卵母细胞质量相关因子的表达,从而提高囊胚形成率及囊胚质量,而AMH主要在CCs上表达。基于以上研究,我们知道CCs上表达的基因参与卵母细胞成熟的调节,有望作为卵母细胞成熟的无创性生物标志,并可能应用于创新IVM培养液,改善IVF临床结局。那么在胚胎早期发育过程中,CCs上是否也存在与胚胎发育潜能相关的生物标志?本实验通过小鼠胚胎体外培养模型,通过RNA高通量测序技术获得小鼠卵母细胞IVM后形成囊胚与未形成囊胚这两组对应CCs之间的差异表达基因,进一步探讨了从差异表达基因内筛选的与早期胚胎发育相关生物标记物。并将这些目的基因在人胚胎体外培养后,比较囊胚形成与否对应CCs上基因表达的改变。此外,本文还结合小鼠卵母细胞体内成熟模型,根据前期获得的IVM前后CCs上基因表达谱系,进一步通过细胞亚定位和定量分析技术探讨与线粒体代谢相关两个基因的表达与卵母细胞质量和胚胎发育潜能的相关性。材料与方法(1)以小鼠早期胚胎发育为模型,体视显微镜下观察囊胚形成情况:在第四或第五天发现胚胎透明带变薄,且有囊胚腔形成视为囊胚形成。收集卵母细胞体外成熟形成囊胚与未形成囊胚对应的CCs和卵母细胞体内成熟形成囊胚对应的CCs,分别提取三组CCs总RNA,运用RNA测序技术获得差异表达基因。(2)对差异表达基因进行生物信息学分析:确定差异表达基因和差异细胞功能及事件。(3)目的基因的确定标准:①所有目的基因均在差异表达基因内筛选,即p≤0.05,差异倍数>2;②目的基因参与前3项差异富集的生物学功能及分子信号通路;③文献报道的与早期胚胎发育相关的基因;④针对目的基因能够设计特异性引物进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证;⑤针对差异基因能够获得特异性的抗体以确定功能基因行后续功能研究。应用与测序上样时同样的样品进行RT-qPCR验证。(4)目的基因在人CCs上的表达:人卵母细胞体外授精后,收集卵母细胞形成囊胚与未形成囊胚对应的CCs,比较囊胚形成与否对应CCs上目的基因mRNA表达的改变。(5)应用小鼠卵母细胞体外成熟及体内成熟模型,从3周龄ICR雌性小鼠获取体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(IVV-COCs)以及GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),并将GV期体外培养至MII期卵丘-卵母细胞复合体(IVM-COCs)。收集对应的CCs,分成GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs三组。RT-qPCR试验检测线粒体相关凋亡因子 2(Apoptosis-inducing factor mitochondrion-associated 2,AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(Ferredoxin 1,FDX1)mRNA水平的表达,激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs的AIFM2和FDX1的亚细胞定位,初步探讨其在卵母细胞成熟过程中的作用。(6)统计方法:采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料(目的基因mRNA表达水平)以均数±标准差(Means±SD)表示,采用独立样本t检验进行分析。P<0.05认为差异有统计学意义。结果(1)运用小鼠早期胚胎发育模型,获得小鼠卵母细胞形成囊胚与未形成囊胚对应的CCs差异表达基因变化。①卵母细胞体外成熟组上共检测到了 57,801个基因。其中48,506个基因在卵母细胞体外成熟后形成囊胚组和未形成囊胚组均有表达(占83.92%),6219个基因只在卵母细胞体外成熟后形成囊胚组上表达(占10.76%),3076个基因只在卵母细胞体外成熟后未形成囊胚组上表达(占5.32%)。②按照FC≥2.0,RPKM≥1以及P≤0.05筛选标准进行差异基因表达分析,并排除在卵母细胞体外成熟后形成囊胚组和阳性对照组之间表达有差异的9个基因。发现卵母细胞体外成熟未形成囊胚组与形成囊胚组比较,有97个基因上调,103个基因下调。这些差异基因主要涉及与骨架形成、细胞黏附和细胞核内相关生物学事件。(2)RT-qPCR验证测序结果:与Wnt信号通路相关基因(ARRB1、LGR4、SIX2和SMC2),与细胞粘附或细胞连接相关基因(CDH5和CNTNAP1),与细胞骨架相关基因(MKLN1和RHOBTB1)和与Ca2+释放和转运相关基因(ATP2C1)。这9个基因在IVM后形成囊胚组CCs上的表达较未形成囊胚组升高,与RNA测序结果相似,其中除了 CNTNAP1和SIX2因子在这两组CCs上的表达差异没有统计学意义外,其余7个因子的表达两组间差异均有统计学意义。(3)人卵母细胞形成囊胚与未形成囊胚组对应的CCs上以上9个基因mRNA表达的变化。ARRB1、LGR4和SMC2在未形成囊胚组的表达较形成囊胚组表达高,且差异有统计学意义,其余6个基因的表达两组间差异没有统计学意义。(4)与线粒体代谢相关的两个基因(AIFM2和FDX1)在三组CCs上(GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs)mRNA表达水平:AIFM2和FDX1 mRNA表达水平在IVM-CCs组和IVV-CCs组均显著高于GV-CCs组,而在IVM-CCs组和IVV-CCs组上AIFM2和FDX1 mRNA的表达量均无显著差异。细胞内定位研究发现,在GV-COC中,AIFM2和FDX1在CCs内外层和卵母细胞中均有表达,主要定位于CCs胞质中;在IVM-COC和IVV-COC中,AIFM2和FDX1在CCs和卵母细胞的胞质和胞核中同样都有表达,且都主要在胞质中表达。COC从GV期到IVM及体内成熟过程中CCs上表达阳性的细胞数目增加,而达到IVM和体内成熟后CCs上荧光强度无显著变化。结论(1)在小鼠早期胚胎发育过程中,随着卵母细胞成熟及囊胚形成,CCs上的基因表达会发生一系列改变。卵母细胞IVM成功受精,再体外形成囊胚,发现CCs上差异表达基因主要参与骨架形成、细胞黏附和细胞连接等功能。ARRB1、ATP2C1、CDH5、LGR4、MKLN1、RHOBTB1 和 SMC2 在形成囊胚组和未形成囊胚组对应CCs上的表达差异有统计学差异。(2)ARRB1、LGR4和SMC2在人卵母细胞未形成囊胚组的表达较形成囊胚组表达高,提示其作为人胚胎早期发育相关CCs上的生物标志的潜在临床应用价值。(3)小鼠卵母细胞成熟后,其CCs上AIFM2和FDX1的表达升高,表明AIFM2和FDX1参与了卵母细胞成熟过程,也有望作为预测卵母细胞成熟的CCs标记物。在IVM培养液中添加AIFM2和FDX1表达产物,则可能促进卵母细胞成熟。本课题组拟对这些生物标志作进一步的研究。