本论文开展重组HBsAg的体外表达、表达后纯化及其发酵罐高密度发酵的研究。 从已确诊的乙肝病人血清中提取DNA,利用Primer 5.0,参照GeneBank发表的序列,设计针对编码HBsAg S基因的特异性引物。PCR扩增S基因,将其分别克隆入毕赤酵母胞内表达载体pPICZA中,成功构建了重组质粒pPICZA-S和pPICZA-SH。构建的重组子经Sac Ⅰ线性化后,LiCl化学法转化入酵母菌株GS 115、X-33、KM71H和SMD1168。利用抗生素Zeocin筛选重组子,诱导表达后,进行SDS-PAGE和ELISA鉴定。结果表明,HBsAg在毕赤酵母中得到胞内表达,未得到分泌表达。然后,进行westem-blotting分析,结果表明目的蛋白能与抗-HBs单克隆抗体发生特异性反应。重组酵母工程菌扩大培养后,筛选表达量高的工程菌株,并确定最佳的诱导表达时间。结果显示,GS115工程菌诱导表达后单位体积的培养基所得的抗原含量最高,根据ELISA检测HBsAg的标准曲线,粗略估算表达量为15.3 mg/L,最佳收获时间为72 h。pPICZA-SH和pPICZA-S表达蛋白分别经Ni-NTA亲和层析和PEG结合层析方法纯化,得到较纯的HBsAg,其免疫原性与抗原活性良好,能够成为工业化生产的优良菌株。筛选的GS115工程菌进行高密度中试发酵的研究,结果表明,发酵96 h为最佳收获时间,表达量达到65.3 mg/L。