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棉铃虫的抗性演化是转Bt棉花能够长期有效种植的潜在风险,增效蛋白的应用作为抗性治理策略的一个方面,能够为延缓棉铃虫抗性演化提供方法。钙粘蛋白和氨肽酶N均是Cry1A毒素在鳞翅目害虫中的受体。有研究报道了原核表达的钙粘蛋白(cadherin, Cad)及氨肽酶N (aminopeptidase N, APN)受体的毒素结合区片段显著增强了Cry1A毒素的效果。本文通过对棉铃虫氨肽酶N毒素结合区片段对Cry1Ac增效的研究,主要得到了以下结果：1.通过基因克隆和原核表达,得到了棉铃虫氨肽酶N毒素结合区APN1tb片段,分子量大小为28 kDa,是预测分子量的两倍。通过镍亲和纯化得到APN1tb纯化片段,通过Western blot检测分析,发现APN1tb纯化片段主要以二聚体形式存在,且存在少量的四聚体和八聚体；2.在Cry1Ac活化毒素中加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段对棉铃虫初孵幼虫的生测结果表明,单独Cry1Ac活化毒素对幼虫的死亡率为44.44±6.056%,而加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段后幼虫死亡率分别为66.67±2.405%、91.66±4.167%、91.67±4.812%,表明APN1tb片段显著增强了Cry1Ac毒素对棉铃虫幼虫的毒性；3.原核表达及纯化得到棉铃虫氨肽酶N毒素结合区缺失片段APN1tb-Del,分子量大小为20 kDa,同样是预测分子量的两倍。通过镍亲和纯化得到APN1tb-Del纯化片段,通过Western blot检测分析,发现APN1tb纯化片段同样主要以二聚体形式存在,且存在少量的四聚体；4.通过比较APN1tb片段和APN1tb-Del片段对Cry1Ac毒素毒性的影响,生测结果表明：APN1tb片段能够显著增强Cry1Ac毒素对棉铃虫幼虫的毒性,而缺失了结合区的APN1tb-Del片段失去了对Cry1Ac毒素增效的能力；5.分别通过ELISA和流式细胞术比较了APN1tb片段和APN1tb-Del片段与Cry1Ac毒素的结合及与刷状缘膜囊泡(BBMV)的结合,结果表明APN1tb片段能够与Cry1Ac高亲和性结合,而APN1tb-Del片段不能与Cry1Ac毒素结合；APN1tb片段和APN1tb-Del片段均能与BBMV结合；6.通过包涵体处理及镍亲和纯化得到APN1tb-Ⅰ片段,在Cry1Ac活化毒素中加入5倍、15倍及50倍APN1tb-Ⅰ片段对棉铃虫初孵幼虫的生测结果表明,单独Cry1Ac活化毒素对幼虫的死亡率为48.61±6.054%,而加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段后幼虫死亡率均为98.61±1.389%,表明APN1tb-Ⅰ片段显著增强了Cry1Ac毒素对棉铃虫幼虫的毒性,且增效能力比APN1tb片段强；7.通过ELISA分析了APN1tb片段和APN1tb-Ⅰ片段与Cry1Ac毒素的结合能力,结果表明两者都能与毒素高亲和性结合,但APN1tb-Ⅰ片段的结合能力比APN1tb片段强,这一结果可能揭示了APN1tb-Ⅰ片段增效能力更强的原因。综上所述,原核表达的APN1tb片段显著增强了Cry1Ac毒素对棉铃虫幼虫的毒性,我们假定了APN1tb片段增效的机理：因为APN1tb片段自身结构的特点,能够形成二聚体或多聚体,而其能够与BBMV结合,推测其可能通过同源聚合而结合到BBMV上GPI锚定的APN受体；APN1tb片段又能够与Cry1Ac毒素结合,因此APN1tb片段可能作为毒素和受体中间的桥梁,使更多的毒素与受体结合。总之,本文对棉铃虫氨肽酶N毒素结合区片段对Cry1Ac毒素增效的研究为延缓抗性的演化提供了一定方法。