背景:Hedgehog（Hh）信号通路在哺乳动物的生长发育过程中发挥重要作用,Hh通路的异常表达也被证明与多种癌症的产生有关。在临床实验中,抑制异常表达的Hh通路已被证明是一种对抗基底细胞癌（BCC）、髓母细胞瘤（MB）等癌症的有前途的治疗干预手段。而在Hh通路中Smo蛋白被广泛的选择作为抑制Hh通路异常表达的靶点,多种以Smo蛋白为靶点的药物与抑制剂已被研发。目的:目前,已经有两个Hh靶向药物（Vismodegib,Sonidegib）被批准用于治疗基底细胞癌,更多的抑制剂正在临床研究中。但是,已经上市的化合物在临床治疗中均产生了很强的副作用以及发现了耐药性的现象。因此,开发新型能够克服耐药作用的Hh通路抑制剂具有非常重要的意义。在此,我们课题组利用复旦大学赵伟利和董肖椿课题组合成的化合物,使用多种体外和体内模型系统鉴定一种新的、耐受良好、具有口服活性的小分子Hh抑制剂。方法与结果:在本研究中,采用Dual-Luciferase Assay Reporter System,筛选了61种含有酞嗪或二甲基哒嗪中心骨架的合成化合物作为新的Hh信号传导抑制剂的候选物。在这些化合物中,L-4抑制作用最强,IC₅₀值为2.23 nM。Brdu法检测细胞增殖,L-4对原代髓母细胞具有很强的生长抑制作用,IC₅₀为31.36 nM,而阳性药Vismodegib和LY-2940680的IC₅₀值分别为37.65 and 35.5 nM,表明L-4具有和阳性药相似的增殖抑制作用。Western Blot显示L-4在体外强烈抑制Hh途径,对原代髓母细胞瘤和Shh-Light II细胞,300 nM的L-4就可以显著抑制Gli1蛋白和Ptch1蛋白。BODIPY-cyclopamine竞争结合实验证明L-4通过拮抗Smo以阻断Hh途径,当L-4浓度达到1μM时就可以竞争拮抗50%相同浓度的荧光环巴胺与Smo的结合,表明L-4和第一代Hh通路抑制剂环巴胺有相似结合Smo蛋白的能力。有意义的是,L-4可显著抑制Smo突变体（D473H）引起的Hh通路活性,L-4作用于转染了野生型和突变型Smo质粒的Shh-Light II细胞,IC₅₀值分别为23.46和24.55 nM,基本保持一致。而上市药物Vismodegib对转染野生型和突变型Smo质粒的Shh-Light II细胞的IC₅₀值分别为21.63和326.8 nM,差距达到15倍之多。分子docking实验同样验证了体外抗耐药实验的结果。动物实验方面,口服给药的L-4在Ptch+/-;p53-/-转基因髓母细胞瘤同种异体移植模型中表现出显着的剂量依赖性抗肿瘤功效,最低剂量的5 mg/kg就有明显的抗肿瘤增殖作用。口服20 mg/kg的L-4之后,肿瘤几乎停止生长,治疗效果与阳性药LY-2940680相当。此外,L-4在使用ICR小鼠的急性毒性试验中显示出良好的耐受性,一次性口服2000 mg/kg的剂量没有产生明显的毒副作用。结论:本研究应用Dual-Luciferase Assay Reporter System筛选出了具有显著Hh信号通路抑制活性的化合物L-4。L-4通过拮抗Smo受体强烈抑制Hh通路,降低Gli1和Ptch1的表达,进而抑制肿瘤生长。L-4在抗耐药方面超越目前处于临床使用的药物。在Ptch+/-;p53-/-髓母细胞瘤移植模型的体内实验中,口服L-4表现出显著的抗肿瘤功效,并且L-4表现出良好的耐受性。我们的研究结果表明,L-4是一种新型靶向Smo蛋白的Hh通路抑制剂,具有抑制髓母细胞瘤活性强、耐受良好、口服有效和抗耐药性等特点。尤其是克服耐药性方面,在细胞水平L-4比上市药物拥有高10倍抑制突变Smo蛋白的能力,这使得L-4成为具有更好治疗效果的Hh抑制剂,是一个很有开发前景的Hh靶向抗肿瘤药物。如能进一步完成L-4的临床前与临床研究,有望解决目前上市药物治疗后产生的耐药性与毒副作用问题,成为接替Vismodegib和Sonidegib的二线新型Hh靶向抗肿瘤药物。