猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是α冠状病毒属的一个成员,它能感染各种年龄的猪。近年来,猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的暴发给全球养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV基因组能编码16个非结构蛋白(NSP1-NSP16)、ORF3、S、M、E、N蛋白,其各个蛋白在病毒生活周期中发挥了重要作用。PEDV S蛋白是病毒表面的膜糖蛋白,它在调控其与宿主细胞表面受体蛋白的相互作用中发挥了至关重要的作用,S蛋白上的抗原表位及受体结合域可以作为疫苗和抗病毒药物研发的靶点。NSP9蛋白具有核苷酸结合特性,它是病毒复制复合体的一员,在病毒复制等过程发挥了重要作用。本研究以PEDV S和NSP9蛋白为研究对象,探索了S蛋白的受体识别特性、NSP9蛋白的结构及其核苷酸结合特性,具体内容如下:1.研究了PEDV S蛋白与其蛋白受体pAPN及其辅助受体糖的识别特性。为鉴定PEDV S1蛋白中的受体结合域,构建了5个不同截短片段的S1蛋白及pAPN蛋白,流式细胞及ELISA实验结果显示PEDV受体结合域位于S1蛋白的C端区域(氨基酸253-638),其受体结合域比其它冠状病毒更宽。CHGD-01 S253-638和CV777S249-634片段序列相似度很高,流式细胞实验结果显示它们结合pAPN的能力相似,表明PEDV经典弱毒株和变异毒株受体结合力没有明显差异。PEDV S1C-terminus(S477-629)与TGEV、HCoV-NL63受体结合域在结构和序列上相似,推测PEDV S1 C-terminus结构中突出于β-barrel区域顶端的3个loop也可能参与了受体的结合,为此,将CHGD-01 S477-629片段的3个loop分别突变为HCoV-NL63对应序列或“SGSGS”,ELISA、点杂交、pull-down实验结果显示突变体蛋白没有完全丧失pAPN结合力,说明预测的3个loop在PEDV S-pAPN互作中并不发挥关键作用,因此,PEDV展现出不同于TGEV、PRCV及HCoV-NL63的受体识别模式。为确定PEDV S蛋白是否具有糖结合能力,构建了全长S1及7个截短蛋白,ELISA实验结果证明S1蛋白的N端具有糖结合能力,同时,CHGD-01 S1-324蛋白结合mucin的能力强于CV777 S1-320蛋白,表明PEDV变异毒株的糖结合力强于经典弱毒株。2.深入研究了PEDV NSP9蛋白的结构及其核苷酸结合特性。经过蛋白的表达、纯化,晶体的初筛、优化等过程,解析了NSP9蛋白的晶体结构,其结构显示NSP9蛋白单体包含7个β-strand和1个位于C端的α-helix。PEDV NSP9蛋白有2种二聚体形式:一种由C端的α-helix平行互作形成,氨基酸Gly95、Gly99和Gly102之间形成了主要的疏水性相互作用;另一种由二硫键及β-strand 4和5之间形成的分子间氢键、疏水性相互作用形成。Crosslinking和AUC实验结果显示NSP9蛋白在溶液中主要以单体和二聚体形式存在。SDS-PAGE及AUC实验结果证实NSP9C59A突变体为单体状态,而NSP9G95E,G99E,G102E突变体状态与野生型NSP9一致,说明二硫键在NSP9蛋白二聚体形成中发挥了关键作用,解析的NSP9C59A突变体的晶体结构进一步证实了以上结果。分析发现大量带正电荷的氨基酸分布于NSP9蛋白结构表面,二聚体界面或单体中间区域展示出很强的带正电荷的能力,表明这是一个可供核苷酸结合的界面。为验证NSP9蛋白中氨基酸Cys59、Gly95、Gly99、Gly102、Lys10、Arg68、Lys69、Arg106是否与其核苷酸结合能力相关,构建了一系列相关突变体,EMSA及MST实验结果表明NSP9蛋白中参与二聚体形成的关键氨基酸Cys59、Gly95、Gly99、Gly102对其核苷酸结合力没有显著影响,而NSP9蛋白结构表面带正电荷的氨基酸在核苷酸结合中发挥了重要作用,同时,PEDV NSP9蛋白与核苷酸结合力的强弱与核苷酸的长度无关。PEDV S蛋白和NSP9蛋白在结构及功能上展现出异于其它冠状病毒的特性,因此,PEDV拥有其独特的入侵、复制、致病机制。本文为阐明PEDV的致病机理奠定了理论基础,为抗病毒药物或疫苗的研发提供了新思路。