VNP20009是一株减毒沙门氏菌，其在野生型沙门氏菌14028遗传背景上敲除致病基因msbB和嘌呤合成基因purⅠ。尽管在小鼠肿瘤模型中，VNP20009具有良好的肿瘤靶向性和抑瘤效果，但是在Ⅰ期临床试验中，其肿瘤靶向能力和抗肿瘤效果均不显著。因此，肿瘤靶向细菌作为一种全新的肿瘤治疗方法，目前还有许多有待深入研究和改进之处。　　细胞代谢异常是肿瘤的重要特征之一，对肿瘤细胞生长至关重要。例如，代谢重编程可以维持肿瘤干细胞自我更新，阻止其分化，增强其抗氧化防御机制;肿瘤细胞可以通过自噬进行自我分解代谢过程，维持自身在营养缺乏环境下的生存;肿瘤细胞在有氧情况下，大量摄取葡萄糖，进行糖酵解，以满足其快速生长的需要。因此，代谢异常也是肿瘤治疗的一个重要靶点，本论文以减毒沙门氏菌VNP20009为研究对象，针对肿瘤细胞代谢异常开展下述系列研究:1）肿瘤干细胞靶向性的VNP20009介导的shABCB5联合化疗药物环磷酰胺抗肿瘤疗效及作用机理研究;2）自噬在VNP20009介导的肿瘤治疗中的作用;3)糖代谢缺陷型菌株的构建和筛选及其对VNP20009抗肿瘤疗效的影响。　　根据文献报道，我们首先进行了潜在肿瘤于细胞标志物的筛选。对小鼠黑色素瘤B16F10细胞进行检测，初步筛选出CD133和ABCB5作为可能的肿瘤干细胞标志物。然后通过流式细胞仪分别分选出CD133+，CD133-，ABCB5+和ABCB5-细胞，采用不同稀释密度分别接种到小鼠腋下，结果显示CD133+与CD133-细胞肿瘤启动细胞频率无显著性差异，而ABCB5+细胞肿瘤启动细胞频率是ABCB5-细胞的6倍。为了进一步证明ABCB5是小鼠黑色素瘤肿瘤干细胞的标志物，我们通过流式细胞仪分选出具有肿瘤干细胞生物学特征的B16F10(CD44+ CD133+ CD24+)，结果显示这一亚群细胞里ABCB5的表达量显著高于B16F10（CD44-CD 133-CD24-）。综上所述，ABCB5可以作为小鼠黑色素瘤B16F10肿瘤干细胞的标志物。　　为了阐明ABCB5在小鼠黑色素瘤生长中的作用，我们通过RNA干扰技术敲除ABCB5基因的表达，记录B16F10 (siABCB5)细胞及其对照组的肿瘤形成情况。结果显示，ABCB5干扰组肿瘤生长缓慢，小鼠肿瘤体积明显小于对照组，表明ABCB5在小鼠黑色素瘤生长中发挥重要作用。接着，我们分析了ABCB5在肿瘤细胞对化学药物产生耐药性中的作用。采用不同浓度的紫杉醇或阿霉素处理B16F10（siABCB5）和对照细胞株，MTT结果显示干扰RNA抑制ABCB5的表达，可以显著增加B16F10小鼠黑色素瘤细胞对紫杉醇和阿霉素的药物敏感性。提示ABCB5可能成为治疗小鼠黑色素瘤的一个潜在的药物靶点。　　当减毒沙门氏菌VNP20009携带ABCB5干扰质粒治疗荷黑色素瘤小鼠时，结果显示其肿瘤大小和小鼠生存率与对照组相比均无显著性差异。于是，我们尝试VNP20009-shABCB5联合化疗药物环磷酰胺治疗荷黑色素瘤小鼠。研究结果显示，VNP20009联合CTX能有效抑制肿瘤生长，但是VNP-shABCB5联合CTX组肿瘤体积进一步缩小、肿瘤倍增时间和小鼠存活时间也有效延长。免疫组化分析显示，VNP-shABCB5联合CTX治疗组Ki-67表达量明显低于其他治疗组。同时TUNEL分析显示VNP-shABCB5联合CTX治疗组细胞死亡比例显著提高。综上所述，VNP-shABCB5联合化疗药物能有效抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞死亡，发挥其抗肿瘤作用。　　肿瘤由于血管发育不完善等原因，很多区域长期处于营养缺乏的状态，为维持自我生存，肿瘤细胞会激活自噬，进行自我分解代谢。第二章中，我们探讨了自噬在VNP20009介导的细菌治疗肿瘤中的作用。通过对减毒沙门氏菌VNP20009侵染GFP-LC3的B16F10细胞进行荧光显微镜及蛋白质印迹分析，我们发现VNP20009侵染细胞可以显著促进LC3-Ⅱ的形成，促进肿瘤细胞发生自噬。为了证实减毒沙门氏菌VNP20009能诱导肿瘤细胞发生自噬，我们又采用了自噬的晚期抑制剂E64d和Pepstatin A进行处理，与VNP20009单独处理相比，在抑制剂存在的条件下，LC-3Ⅱ的表达量显著升高，表明减毒沙门氏菌VNP20009诱导小鼠黑色素瘤细胞发生自噬。　　氯喹作为自噬与溶酶体融合的抑制剂，它可以通过提高溶酶体的pH值，抑制自噬体与溶酶体的融合而使LC3-Ⅱ的表达量增加。细胞水平上，VNP20009和氯喹联合治疗组中LC3-Ⅱ的表达量是氯喹或VNP20009单独治疗的两倍，表明氯喹可以抑制VNP20009诱导的自噬。此外，通过流式分析，联合治疗还可以显著提高细胞死亡，并且随着细菌感染复数的增加或侵染时间的延长而增多。为了验证抑制细菌诱导的自噬能促进肿瘤细胞死亡，我们通过RNA干扰技术抑制自噬的相关基因ATG5或ATG7。结果显示，与对照组相比，ATG5或ATG7沉默后肿瘤细胞死亡率显著高于对照组，并且随着细菌感染复数的增加或侵染时间的延长而增多，表明抑制减毒沙门氏菌VNP20009诱导的自噬可以促进肿瘤细胞死亡。　　动物水平上，我们使用氯喹和减毒沙门氏菌VNP20009治疗荷黑色素瘤小鼠，研究结果显示，联合治疗可以显著抑制肿瘤生长，延迟肿瘤倍增时间和肿瘤生长延迟时间，延长小鼠存活时间，表明氯喹可以提高VNP20009的抗肿瘤能力。对肿瘤内的细菌滴度进行分析发现，氯喹可以提高细菌的肿瘤靶向性，并且通过TUNEL染色分析显示VNP20009联合氯喹治疗荷瘤小鼠后，小鼠肿瘤组织内细胞死亡比例明显提高。同时，对小鼠肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和粒细胞的浸润情况进行分析，结果显示，与VNP20009单独治疗组相比，联合治疗后，CD8+T细胞和粒细胞的浸润比例进一步增加。综上所述，通过氯喹抑制VNP20009诱导的自噬可以通过增加肿瘤内细菌滴度，增强细菌毒性，提高机体抗肿瘤免疫反应，从而增强VNP20009的抗肿瘤作用。　　肿瘤代谢异常的另一个主要特点是肿瘤细胞以糖酵解作为主要的能量获取方式，大量摄取葡萄糖。第三章中，我们主要围绕细菌糖酵解代谢途径在VNP20009介导的细菌治疗肿瘤中的作用进行研究。蛋白质组学分析发现，VNP20009治疗荷黑色素瘤小鼠后，肿瘤组织内参与糖酵解和氧化磷酸化的蛋白显著下调，表明VNP20009治疗影响小鼠肿瘤组织内的糖酵解和氧化磷酸化途径。本研究使用RED同源重组方法将细菌内负责糖代谢的cra基因、葡萄糖运输的ptsG基因、己糖-6-磷酸运输的uhpT基因、糖酵解的pykF和pfkB基因和糖异生的glpX基因分别敲除，并分析突变菌株的抗肿瘤效果。结果显示在4T1小鼠乳腺癌和B16F10小鼠黑色素瘤中，uhpT基因缺失不影响VNP20009的抗肿瘤效果，但cra、ptsG、pfkB和pykF基因缺失后，VNP20009的抗肿瘤疗效部分或完全丧失，说明这些基因对VNP20009的抗肿瘤疗效非常关键，提示VNP20009的糖代谢功能对VNP20009抑制肿瘤生长至关重要。　　菌株筛选过程中，我们发现敲除编码将果糖-1，6-二磷酸催化成果糖-6-磷酸的果糖-1，6-二磷酸酶(glpX)后，VNP20009(glpX)表现出优于VNP20009的抗肿瘤效果。与VNP20009相比，VNP20009(glpX)可以更有效地抑制B16F10小鼠黑色素瘤和4T1小鼠乳腺癌细胞生长，延长小鼠存活时间。体外实验结果表明，glpX基因缺失不影响菌株体外生长速率、巨噬细胞侵染率和巨噬细胞内增殖率。与VNP20009相比，VNP20009(glpX)菌株葡萄糖的摄取能力和对肿瘤细胞的毒性都有所增强，还能够促进荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织内CD4+T细胞、CD8+T细胞、粒细胞或天然杀伤性细胞的浸润。此外，悬液芯片分析显示VNP20009(glpX)治疗组小鼠肿瘤组织，GM-CSF、TNF-α和INF-γ细胞因子水平较VNP20009组显著上调，结果表明，VNP20009(glpX)细菌治疗可以更加显著地改善肿瘤内TH 1/TH2平衡，使其更趋向于TH1。　　最后我们对VNP20009(glpX)菌株的安全性进行了评估，与VNP20009组相比，感染VNP20009(glpX)不会影响BALB/c小鼠的体重以及肝脏、脾脏的重量，并且VNP20009(glpX)组的肝脏和脾脏的细菌滴度与VNP20009组也无显著性差异。感染VNP20009(glpX)三天内进行免疫分析，脾脏内CD4+T细胞、CD8+T细胞和中性粒细胞的浸润比例与VNP20009组无显著性变化;并且在感染后第3天，VNP20009(glpX)组中巨噬细胞浸润减少，表明VNP20009(glpX)具有和VNP20009相同的生物安全性。　　综上所述，VNP20009通过其糖代谢途径影响肿瘤代谢微环境发挥抗肿瘤作用，敲除glpX基因不仅可以增强其葡萄糖糖摄取能力，并且可以增强其免疫原性和抗肿瘤能力。