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研究背景和目的:糖尿病是临床常见病,其并发的糖尿病神经病理痛在临床上也常见。文献表明背根神经节P2X3受体在糖尿病神经病理痛时表达明显增加,P2X3受体拮抗剂可减轻糖尿病大鼠痛敏反应。由此显示背根神经节的P2X3受体参与糖尿病大鼠神经病理痛的病理变化,从而为糖尿病并发的顽固性神经病理性疼痛的治疗提供新的靶点。背根神经节合成的降钙素基因相关肽(CGRP)是一种主要的感觉神经递质,也参与糖尿病大鼠神经病理痛。研究报道类似mRNA的非编码RNA(mlncRNA)表达的变化和影响mlncRNA因素的改变与神经性疾病有关。本项目前期研究应用SOLiD高通量大鼠转录组数据检测和序列预测筛选发现糖尿病模型大鼠背根神经节组织可高表达mlncRNA2。本研究通过观察mlncRNA2小干扰RNA(siRNA)在糖尿病神经病理痛中的作用,为糖尿病神经病理痛的防治新方法提供实验基础。方法:采用2型糖尿病大鼠模型进行实验,本实验大鼠随机分为:生理盐水对照组(Ctrl+NS),糖尿病模型+生理盐水对照组(DM+NS),糖尿病模型+mlncRNA2 siRNA 处理组(DM+mlnc2 si),糖尿病模型 + scrambled siRNA 阴性对照组(DM+SC si)。实验内容:1、在实验过程中测量各组大鼠体重、空腹血糖和餐后血糖的变化。2、测量各组大鼠的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期。3、测量各组大鼠的尾神经感觉传导速度。4、测量各组大鼠血脂和空腹血胰岛素水平。5、采用免疫组化和蛋白印迹的方法检测各组大鼠背根神经节P2X3受体和CGRP的表达变化。6、采用逆转录-聚合酶链式反应的方法检测各组大鼠背根神经节上mlncRNA2、P2X3受体和CGRP的表达变化。7、测量各组大鼠血清TNF-α水平。8、测量各组大鼠血清氧化应激指标—过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性。结果:1、在给予高糖高脂饮食后(第5周末),模型组大鼠体重增加比正常组大鼠体重增加明显快(p<0.01,F3,28=36.85);而成模后(第8周末),模型组大鼠体重增加比正常组大鼠体重增加慢的多(p<0.05,F3,28=3.81)。在第7周末,造模组大鼠的空腹血糖和餐后血糖均达到了糖尿病诊断水平,而Ctrl+NS组大鼠的空腹血糖和餐后血糖均在正常范围,表明2型糖尿病造模成功。给予mlncRNA2小干扰RNA处理后,DM+mlnc2 si组的空腹血糖和餐后血糖显著降低,与DM+NS组和DM+SC si组相比有显著性差异(p<0.01,空腹血糖F2,21=11.44,餐后血糖F2,21=15.28),而DM+NS组和DM+SC si组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。2、在2型糖尿病造模过程中,模型组大鼠的MWT和TWL开始降低,造模成功后2型糖尿病模型组大鼠的MWT和TWL值与Ctrl+NS组相比有显著性差异(p<0.01,MWT-F3,28=21.87,TWL-F3,28=13.32),给予 mlncRNA2 小干扰RNA处理后,DM+mlnc2 si组的MWT和TWL值较DM+NS组和DM+SC si 组明显升高,有显著差异(p<0.01,MWT-F2,21=13.54,TWL-F2,21=12.36),而DM+NS组与DM+SC si组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。3、在2型糖尿病造模过程中,模型组大鼠的尾神经感觉传导速度(SCV)开始降低,造模成功后模型组大鼠的SCV与Ctrl+NS组相比有显著性差异(p<0.01,F3,28=21.37),给予mlncRNA2小干扰RNA处理后,DM+mlnc2 si组的SCV与DM+NS组和DM+SC si 组相比有显著性差异(p<0.01,F2,21=32.56),而 DM+NS 组与 DM+SC si组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。4、血脂结果表明,DM+NS组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平较Ctrl+NS组明显升高,有显著意义(p<0.01),给予 mlncRNA2 小干扰 RNA 处理后,DM+mlnc2 si 组与 DM+NS 组和 DM+SC si组相比其总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平明显降低,有统计学意义(p<0.01,TC-F2,21=23.46,TG-F2,21=28.88,LDL-F2,21=41.09),而 DM+NS 组与DM+SC si组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。DM+NS组高密度脂蛋白水平较Ctrl+NS组明显降低(p<0.05),给予mlncRNA2小干扰RNA处理后,DM+mlnc2 si组与DM+NS组和DM+SC si组相比其高密度脂蛋白水平明显升高,有统计学意义(p<0.05,F2,21=6.39),而DM+NS组与DM+SCsi组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。DM+NS模型组、DM+mlnc2 si组和DM+SC si组空腹血胰岛素水平较 Ctrl+NS 组明显升高(p<0.05,F3,28=4.01),DM+NS 模型组、DM+mlnc2 si组和DM+SC si组三组之间空腹血胰岛素水平差异无统计学意义(p>0.05,F2,21=2.88),糖尿病组的IRI显著低于正常组大鼠,具有统计学意义(p<0.05)。5、RT-PCR结果表明,DM+NS组背根神经节mlncRNA2、P2X3受体和CGRP的表达较Ctrl+NS组明显升高,有统计学意义(p<0.01),DM+mlnc2 si组较DM+NS组和DM+SC si组明显降低,有统计学意义(p<0.01,mlncRNA2-F2,27=43.21,P2X3-F2,27=34.14,CGRP-F2,27=23.33),而 DM+NS 组与 DM+SC si 组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。6、免疫组化、western blot结果表明,DM+NS组背根神经节P2X3受体和CGRP的表达较Ctrl+NS组明显升高,有统计学意义(p<0.01),DM+mlnc2si组较DM+NS组和DM+SCsi组明显降低,有统计学意义,有统计学意义(p<0.01,组化:P2X3-F2,27=28.12,CGRP-F2,27=21.97,蛋白印迹:P2X3-F2,27=13.32,CGRP-F2,27=10.52),而 DM+NS 组与 DM+SCsi 组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。7、免疫荧光双标结果表明,糖尿病模型组大鼠背根神经节神经元P2X3受体和CGRP的表达上调,而mlncRNA2小干扰RNA能抑制此上调作用。8、大鼠血清TNF-α水平测量结果表明,DM+NS组血清TNF-α水平较Ctrl+NS组明显升高,有统计学意义(p<0.01),DM+mlnc2 si组较DM+NS组和DM+SCsi组明显降低,有统计学意义(p<0.01,F2,21=45.34),而DM+NS组TNF-α浓度与DM+SC si组之间无显著差异(p>0.05)。9、氧化应激结果表明,DM+NS组血清CAT和SOD活性较Ctrl+NS组明显降低,有统计学意义(p<0.01),DM+mlnc2 si组CAT和SOD活性较DM+NS组和DM+SC si组明显增加,有统计学意义(p<0.01,CAT-F2,21=11.33,SOD-F2,21=13.46),而 DM+NS 组与 DM+SC si组相比其差异无统计学意义(p>0.05)。结论:mlncRNA2小干扰RNA对背根神经节上的P2X3受体和CGRP介导的糖尿病大鼠神经病理性疼痛具有抑制作用。