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目的:探讨去整合素kistrin与人晶状体上皮细胞株SRAOI/04的细胞凋亡之间的关系及其对细胞周期的影响。
方法:对人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)进行培养,取对数生长期细胞进行实验。
①流式细胞仪检测细胞凋亡:细胞孵育采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培养基,其中kistrin的实验终浓度分别为: Ong/ml(对照组),80ng/ml,160 ng/ml,320 ng/ml。分别作用8h,16h,32h后将细胞消化,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
②吖啶橙染色观察细胞凋亡形态学变化:处于对数生长期的细胞用含lO%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基孵育,其中ki strin的实验终浓度为:0ng/ml(对照组)和160 ng/ml。于24h,32h后进行细胞凋亡的染色,用倒置相差荧光显微镜观察。染色前用相差显微镜对细胞进行观察,并拍照。
③流式细胞仪检测细胞周期:将悬浮细胞均匀接种于6孔板。加入含血清的DMEM/F12培养基培养48h后改换不含血清的DMEM/F12培养基培养24h进行同步化。之后又改为实验用的DMEM/F12完全培养基,其中kistrin的实验终浓度为浓度分别为0ng/ml(对照组),160ng/m1和320ng/ml(实验组)。同样条件下分别孵育24h后用流式细胞仪检测细胞周期变化。
结果:
1.kistrin对细胞凋亡有明显的诱导作用。8h,16h,32h这3个时间点中不同浓度组(0ng/ml,80ng/ml,160 ng/ml,320 ng/ml)的凋亡率分别为8h时:1.29%,5.48%,11.23%,20.77%。16h时:3.04%,7.68%,18.76%,32.36%。32h时:4.75%,72.15%,54.09%,43.27%。在每个时间点内各浓度的凋亡率与阴性对照组(0ng/ml)的凋亡率相比,差异均有显著性(P<0.01),各浓度的细胞凋亡率之间差异也均有显著性(P<0.01),在同一时间点内细胞的凋亡率有浓度依赖性。
2.与阴性对照组(0ng/ml)相比,浓度为160 ng/ml的kistrin作用24h后,细胞形态明显改变,但吖啶橙染色未见明显凋亡的形态学改变。32h后吖啶橙染色发现细胞出现凋亡形态改变,未见坏死。
3.kistrin作用于细胞后,实验组的细胞周期与阴性对照组(0ng/ml)的相比,出现阻滞。浓度为160ng/ml和320ng/ml的kistrin作用于细胞24h后的细胞周期G1期分别为66.0%(160ng/ml组)和68.3%(320ng/ml组);阴性对照组(0ng/ml)Gl期:36.9%。实验组的构成比与对照组的相比,差异有显著性(P<0.0l),实验组的细胞明显阻滞于Gl期。
结论:去整合素kistrin对SRAOI/04有诱导凋亡作用,引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,有望成为防治后发障的有效药物。