论文部分内容阅读
铁(Fe)是植物生长发育所必需的矿质元素之一。作为很多功能蛋白的辅助因子,铁参与许多生化过程,包括叶绿素的生物合成,光合作用和呼吸作用等。对人类而言,缺铁是全世界最普遍的营养失调之一,而谷物、水果和蔬菜是人类获得铁的主要来源之一。因此,研究植物体内的铁稳态机制对人类健康具有重要意义。为了维持铁稳态,高等植物已经进化出两种复杂的铁吸收机制,即还原机制(机制I)和螯合机制(机制II)。非禾本科植物主要利用还原机制,而禾本科植物则主要采用螯合机制。水稻作为特殊的禾本科植物,除了具有螯合机制以外,还可以利用部分的还原机制,因为水稻不仅可以分泌麦根酸类植物铁载体螯合Fe(III),还可以通过OsIRT1和OsIRT2直接吸收还Fe(III)。尽管如此,水稻感知铁水平并调控铁稳态相关基因表达的分子机制目前尚不清楚。近来,OsHRZ1和OsHRZ2被鉴定为潜在的铁感应蛋白,在铁充足情况下它们负调控铁吸收过程。然而,OsHRZ1和OsHRZ2如何调控缺铁响应相关基因的表达还不清楚。OsHRZ1和OsHRZ2均具有E3连接酶活性,暗示它们可能通过泛素化途径影响底物蛋白的稳定性。因此,鉴定并且确认OsHRZI和OsHRZ2的底物蛋白可以为水稻缺铁响应提供新见解。本研究通过酵母双杂交实验筛选到OsHRZ1的一个互作蛋白,该蛋白它属于bHLH转录因子家族,我们将其命名为POSITIVE REGULATOR OF IRON HOMEOSTASIS 1(OsPRI1)。瞬时表达实验表明OsHRZ1和OsPRI1共定位于细胞核。体外pull-down实验证实了 OsHRZ1与OsPRI1的蛋白互作关系。为了研究OsPRI1基因的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术对OsPRI1基因进行了编辑,获得了对应的三种不同的功能缺失突变体,并且所有突变体植株都表现出明显的缺铁敏感表型,如黄化叶。铁含量测定发现,突变体植株的地下部分(根)含有较高的铁浓度而地上部分则含有较低的铁浓度。进一步的表达分析表明,突变体植株中缺铁响应相关基因(如OsIRT1,OSIRT2,OsNAS1,OsNAS2,OsYSL2,OsYSL15,OsIR02和OsIRO3)的表达均大幅下调。酵母单杂(Y1H)实验以及凝胶阻滞(EMSA)实验证实OsPRI1蛋白可以直接结合OsIRO2和OsIRO3的启动子。鉴于OsHRZ1具有E3连接酶活性并且可以与OsPRI1相互作用,我们推测OsPRI1可能受到OsHRZI的泛素化调控。我们在大肠杆菌细胞中表达并纯化了 GST-OsHRZI和His-OsPRI1蛋白,然后进行了体外泛素化实验。结果表明,OsHRZ1可以介导OsPRI1蛋白的泛素化。为了研究OsPRI1的蛋白稳定性,我们进行了无细胞系降解(Cell-free degradation)试验。在野生型根提取物中OsPRI1蛋白迅速降解,而在hrz1-2突变体根提取物中OsPRIi蛋白的降解则明显延迟。我们也发现OsPRI1的降解可以被MG132完全抑制。这些结果表明OsPRI1被OsHRZ1泛素化并通过26S蛋白酶体途径降解。为了研究OsPRI1与OsHRZ1之间的遗传关系,我们构建了pri1hrz1双突变植株。缺铁实验表明,hrz1pri1双突变体比hrz1-2突变体对缺铁更敏感,而比pri1-1更不敏感。这些结果表明OsPRI1在OsHRZ1的下游起作用调控水稻的铁平衡。本研究表明,OsPRI1受OsHRZ1的泛素化降解调控,而OsPRI1正调控OsIRO2和OsIRO3的表达,这个OsHRZ1-OsPRI1-OsIRO2/3信号转导级联通路在维持水稻铁平衡方面起着重要作用。