【摘 要】
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胍基丁胺和1,4-丁二胺属于氨基酸衍生物,是生物多胺,在多个领域都有重要的应用。以L-精氨酸为前体,在精氨酸脱羧酶作用下脱羧合成胍基丁胺,再由胍丁胺酶催化生成1,4-丁二胺。本研究通过合成生物学和代谢工程等手段在钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5中构建胍基丁胺和1,4-丁二胺的合成路径并提高产量。主要内容如下:（1）将来源于E.coli K-12的两种精氨酸
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胍基丁胺和1,4-丁二胺属于氨基酸衍生物,是生物多胺,在多个领域都有重要的应用。以L-精氨酸为前体,在精氨酸脱羧酶作用下脱羧合成胍基丁胺,再由胍丁胺酶催化生成1,4-丁二胺。本研究通过合成生物学和代谢工程等手段在钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5中构建胍基丁胺和1,4-丁二胺的合成路径并提高产量。主要内容如下:（1）将来源于E.coli K-12的两种精氨酸脱羧酶在C.crenatum SYPA5-5中过表达,通过酶活测定和摇瓶发酵产量比较,选择表达合成型精氨酸脱羧酶的重组菌PC2（C.crenatum/pXMJ19-speA）进行胍基丁胺的生产,通过补料分批发酵生产39.4 g·L-1胍基丁胺,转化率为0.26 g·g-1葡萄糖。（2）将来源于E.coli K-12的两种鸟氨酸脱羧酶,合成型精氨酸脱羧酶和胍丁胺酶在C.crenatum SYPA5-5中异源表达,构建三株1,4-丁二胺生产菌株,摇瓶发酵结果显示PC5（C.crenatum/pXMJ19-speA-speB）具有更高1,4-丁二胺生产潜力,但有中间产物胍基丁胺积累。利用强度不同的RBS序列调节胍丁胺酶的表达水平,通过酶活测定发现,重组菌株PC5-6（C.crenatum/pXMJ19-speA-R6speB）的胍丁胺酶酶活是对照菌株PC5的1.8倍,重组菌PC5-6全细胞转化的1,4-丁二胺产量比对照菌提高30.3%,达到67.9 g·L-1,PC5-6的1,4-丁二胺摇瓶发酵产量达到14.9 g·L-1,比对照菌提高44.8%。（3）对底盘菌株进行代谢改造减少1,4-丁二胺的降解、提升胞外转运能力进一步增产1,4-丁二胺。敲除N-乙酰转移酶基因sna A减少1,4-丁二胺乙酰化降解,单敲菌株PC7（C.crenatumΔsna A/pXMJ19-speA-R6speB）摇瓶发酵生产1,4-丁二胺18.2 g·L-1,比对照菌PC5-6提高了25.3%;通过敲除亚精胺合酶基因speE减少1,4-丁二胺的下游代谢,双敲菌株PC9（C.crenatumΔsna AΔspeE/pXMJ19-speA-R6speB）的1,4-丁二胺产量比PC7提高了7.8%,达到19.6 g·L-1;敲除转运蛋白Cgm A的阻遏基因cgm R,增强1,4-丁二胺的胞外转运能力,三敲除菌株PC11（C.crenatumΔsna AΔspeEΔcgm R/pXMJ19-speA-R6speB）的1,4-丁二胺产量进一步提升10.3%,达到21.7 g·L-1。通过代谢改造得到重组菌株PC11,以葡萄糖为底物生产1,4-丁二胺21.7 g·L-1,比PC5-6提升49.1%。（4）为拓展底物范围,以双质粒系统在菌株PC11中构建来源于E.coli K-12的木糖代谢途径,通过以木糖为碳源的生长性能测定和摇瓶发酵筛选出共同过表达木糖异构酶和木酮糖激酶的PC14（PC11/p EC-XK99E-xyl AB）,在混糖和模拟小麦秸秆水解液的摇瓶发酵中分别能生产18.5 g·L-1和17.0 g·L-1 1,4-丁二胺。（5）最终,将PC11和PC14在5 L发酵罐进行补料分批发酵,重组菌PC11以葡萄糖为底物发酵72 h生产1,4-丁二胺41.5 g·L-1,转化率为0.18 g·g-1葡萄糖。菌株PC14以混糖为底物发酵72 h合成1,4-丁二胺36.8 g·L-1,转化率为0.15 g·g-1总糖。菌株PC14以模拟小麦秸秆水解液发酵72 h生产33.4 g·L-1 1,4-丁二胺,转化率为0.14 g·g-1总糖。
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