论文部分内容阅读
本论文包含两部分研究内容:(一)冬凌草甲素靶向治疗t(8;21)急性髓系白血病的机制研究——冬凌草甲素靶向破坏AML1-ETO融合蛋白的多聚化,产生?AML1-ETO;(二)急性早幼粒细胞白血病的发病和砷剂靶向治疗的机制研究——PML的四聚化是PML和PML-RARα功能发挥和砷剂作用的基础。通过对两类白血病发病机制和靶向治疗机制的研究,发现癌蛋白的多聚化是其致病的基础,而靶向药物对其多聚化状态的改变是药物发挥作用的关键,这对我们更深层次理解白血病的发病原理和寻找更有效的治疗方案奠定了理论基础。第一部分:冬凌草甲素靶向治疗t(8;21)急性髓系白血病的机制研究——冬凌草甲素靶向破坏AML1-ETO融合蛋白的多聚化,产生ΔAML1-ETOt(8;21)(q22;q22)染色体易位是急性髓系白血病中最常见的染色体易位,占其中的12-20%,该染色体易位产生了AML1-ETO融合基因。研究表明其编码的AML1-ETO融合蛋白的同源多聚化及其对靶基因的转录调控异常是t(8;21)白血病发病的基础,AML1-ETO是治疗此类白血病的重要药物靶点。目前利用诱导疗法治疗该类型白血病患者,约有60%的患者未能获得长期缓解。之前的研究发现,冬凌草甲素可以特异性诱导t(8;21)白血病细胞凋亡,并通过caspase-3依赖的途径剪切AML1-ETO产生剪切片段ΔAML1-ETO。但是,AML1-ETO是否是冬凌草甲素的直接分子靶点、冬凌草甲素的作用机制、ΔAML1-ETO的产生机理及生物学功能等问题都尚待研究。在本研究中,我们发现冬凌草甲素可以通过与谷胱甘肽、硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶的巯基直接结合,迅速提高细胞内活性氧水平,活化caspase-3;而且冬凌草甲素与AML1-ETO蛋白直接结合,使caspase-3只在其188位进行切割,从而产生ΔAML1-ETO并抑制其被caspase-3进一步降解。ΔAML1-ETO通过NHR2结构域与AML1-ETO相互作用,破坏AML1-ETO的多聚化,干扰AML1-ETO的功能,解除AML1-ETO对其靶基因的转录抑制,发挥类似于肿瘤抑制因子的功能。此外,冬凌草甲素还可以抑制c-Kit阳性的白血病起始细胞的活性,延长AML1-ETO9a小鼠的生存期。因此,冬凌草甲素可以靶向作用于癌蛋白AML1-ETO,是一个潜在的白血病分子靶向治疗药物。另外,我们发现,ETO是与PML共定位的,ETO也可能参与PML核体的组装和功能发挥。第二部分:急性早幼粒细胞白血病的发病和砷剂靶向治疗的机制研究—PML的四聚化是PML和PML-RARα功能发挥和砷剂作用的基础急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一种临床表现十分凶险但现在可以高度治愈的急性白血病,在AML中占10-15%,95%以上伴有t(15;17)(q22;q21)染色体异位,产生PML-RARα融合蛋白。PML-RARα形成同源二聚体或多聚体,募集转录共抑制因子,引起粒细胞分化相关的靶基因的转录抑制,从而导致APL的发生。靶向治疗APL的三氧化二砷可以与PML/PML-RARα直接结合,促进PML/PML-RARα多聚化,进而发生SUMO化和泛素化,最终通过蛋白酶体途径降解。PML蛋白主要定位在细胞核内的亚细胞器PML核体中,PML的多聚化是PML核体结构和功能的基础。PML-RARα可以与PML形成异源二聚体导致PML核体的正常结构被破坏。为了在分子水平上更深层次地理解PML/PML-RARα的结构和功能及砷剂的靶向作用机制,我们在结构生物学上进行了探索和分析。我们获得并解析了PML-RING的四聚体晶体结构,发现四个亚基通过2个高度保守的氨基酸界面组成高度对称的环状结构。这种四聚体状态对于PML和PML-RARα的功能都是非常重要的。聚合界面的破坏,会影响PML的多聚化状态、PML核体的生物学组装和SUMO化、PML-RARα的功能以及它们对砷剂的反应,甚至可能影响APL的发病。